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(無題) 削除/引用 No.10570-9 - 2022/07/02 (土) 17:28:27 - 衛藤 皆さま、ありがとうございます。 一度、遺伝子編集をした胚のゲノムから編集した箇所周辺を取り出し、ベクターに入れてクローニングしたことがありました。コロニーをつついてPCRするとラダー状のバンドが出て、複数のコロニーをつついちゃったのかなと首を傾げたことがありました。しかし、今思うと導入した量が多すぎて、1コロニー内にモザイク状に、特定の編集産物が導入されたプラスミドを持った大腸菌が、複数混じった状態だったのかなとふと思いました。別のステップでミスっていた可能性も勿論ありますが。 トランスフォームするプラスミドの量をもっとちゃんと検討しようと思いました。

(無題) 削除/引用 No.10570-8 - 2022/06/22 (水) 11:37:18 - asan この記事の考察によると、状況によっては2種類のプラズミドベクターが増えることはあり得る、となりますね。 https://bitesizebio.com/2267/plasmid-retention/

(無題) 削除/引用 No.10570-7 - 2022/06/22 (水) 10:31:46 - G25 質問者さんの実験のようなケースでは、一個の細胞（菌体）に複数のプラスミドが入るという確率は限りなく低い。もし、そんな細胞のコロニーを拾ったとしたら、ものすごい幸運の（あるいは不運の）持ち主でしょう。 それが、複数種のプラスミドが入ったものが取れてこない理由の第一です。 先生の言っていたのはプラスミドの不和合現象のことでしょうが、それが説明になるかどうか疑問です。 複数種の同一レプリコンが入った細胞があっても、分裂増殖しているうちに、一個の細胞にはどれか一種類しか存在しない状態になるわけですが、分裂増殖の結果生じる個々の子孫細胞でどのプラスミドが残っているかというのはバラバラになるんじゃないでしょうかね。 結果として、その培養液から精製すると、複数種のプラスミドが混じることになるんじゃないでしょうか。ちょうど、コロニーの単離をしくじって、中身の違う複数のコロニーを植菌したように。 コロニー形成中に、各細胞が単一種のプラスミドしかもたない状態になるまで増殖していて、そこからstreakして更に単一コロニーを取得したとでも言うなら、不和合性で矛盾無いですけど。 いかがでしょう？

(無題) 削除/引用 No.10570-6 - 2022/06/22 (水) 08:30:59 - おお ライブラリーをTransfectionするようなときは濃度を調整して大腸菌１つあたりに一つのプラスミドが入るぐらいにすることもあります（たしか）。site-directed mutagenesisなど微妙なときなどはそのへんも考慮するといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10570-5 - 2022/06/22 (水) 08:03:50 - momo すみません、衛藤さんのお名前を呼び捨てにしてしまっていました。

(無題) 削除/引用 No.10570-4 - 2022/06/22 (水) 08:02:47 - momo AAさんがまとめてくださっているように、衛藤のご心配どおりその方法で調製したプラスミド標品には複数クローンが混在している可能性があります。ただし、コンピテントセルを飽和してしまうような量を形質転換に用いないかぎり、そもそも複数クローンが同じ大腸菌細胞に取り込まれる確率は高くないでしょうし、起こっていたとしても異種プラスミドのsegregationはごく初期に起こるので、夾雑してくる異種プラスミドは多くの利用目的で問題にならないようなレベルの少量になるだろうと思われます。 とは言っても、site-directed mutagenesisで、single cloneだと思っていたプラスミドをsequenceしたらWTとmutantが重なったピークが出た経験が数回あります。2つのプラスミドの構造がほとんど同じ場合には競合が働きにくいのかな？

(無題) 削除/引用 No.10570-3 - 2022/06/21 (火) 20:12:24 - おお AAさんの指摘していることは、トランスフォーメーション後から起こっていてプレート上ですでに一つのクローンで一種類のプラスミドが入っていると言っていいほどドミナントになっています。複製の効率などで優位なプラスミドは複製のたびにドミナントになると言う感じです。 気持ち悪い、完全に同種のプラスミドだけにしたいときは、コロニーを一度ストリーキングしてもう一度シングルコロニーから増やし直すという事もあります、

(無題) 削除/引用 No.10570-2 - 2022/06/21 (火) 17:10:39 - AA プラスミドの不和合性といって、同じタイプの複製起点をもつ（＝同じ仕組みで複製される）プラスミドが複数同時に同じ大腸菌の中に導入された場合、どれか一つしか複製されない、と考えられています。 指導教官の先生がおっしゃられたかったのはそういうことだと思います。 この話題は以前からこの掲示板でも定期的に話題になっていたようで、以下のような過去ログがありました。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3040 トピック中で行われた実験をみると、必ずしも1種類のみともならない、という結論のようです。

震盪培養後のプラスミドについて 削除/引用 No.10570-1 - 2022/06/21 (火) 14:49:29 - 衛藤 学部生時代、コンピ(DH5α)にトランスフォーメーションしてプレートに撒き、それをつついて1mLのLB中でオーバーナイトで震盪培養したのちにキットでプラスミドを回収していました。 その際、複数種類のプラスミドが入っちゃうことはないんですかと先生に聞いたら、「一晩震盪しているうちに1つを残して出ていくから大丈夫」と言われました。 そのときはそれ以上深く聞かずに「へーそうなんですか」と言って済ませてしまい、それ以降はなんとなく震盪培養すれば1種類のプラスミドになるから大丈夫と思いながら実験していました しかし、今になってあれって結局どういうことだったんだろうと思うようになりました。 先生が言っていたことは、 1つの大腸菌に複数のプラスミドが入っても、振盪培養するうちに1種類を残し出ていくということでしょうか？ だとしたらプラスミドAとプラスミドBの2つのプラスミドが入った場合、どちらか1つが残った大腸菌が混在するということにはならないのでしょうか？ あるいは、複数のコロニーをつついた場合にも浸透培養の結果、最終的には1つのコロニー由来の大腸菌に落ち着くということなのでしょうか？ また、これらのことが起こるのだとしたら、それはどのような原理で起こるのでしょうか？ 素人質問なのかも知れませんが、先生も亡くなってしまい聞ける人がいなくなってしまいました。 ご教授頂けると幸いです。

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