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(無題) 削除/引用 No.10564-29 - 2022/08/06 (土) 06:25:37 - m 一応、追加させていただきます。PCRから翌日夕までにミニプレップ完了することは可能です。急げば２４時間くらい。（RNAからではありません）・・現在、論文投稿中。（ゴミ内容ではありますが） 大腸菌のインキュベーション時間を減らす方法はいくつかあります。 朝トランスフォームして、夜に拾い、翌日ミニプレップ。・・・できます。 午後トランスフォームして、夜中に拾い、翌日昼ミニプレップ。可能です。 朝拾って、午後から夜にミニプレップも可能。普通の大腸菌株でもできます。 他に、コロニーを直接解析する方法もあります。Expressクローニングチェッカーキット。（大きいコロニーなら可能と聞きます。高コスト） ・・・しかし、コロニーはある程度以上の大きさのものを拾い、１２時間以上培養した方が、収量もいい。 インキュベーションを短くしても、手を動かす時間・量は同じ。往々にして増える。急ぐと、制限酵素での解析も、数種類で終わらせ、発現ベクターへ組み換えるのを優先してしまう。・・・結局、発現が上手くいかず、結果はゼロ・・・多いです。数やるよりも、歩留まりアップが肝要かと。 ・・・PCR系の実験は、最初に、シークエンスがきちっとしているもの（例　klenowで2本鎖を作るライブラリーは読み間違えが少ない）に比べ、仕事量が増えます。 多くの遺伝子は、すでにデータベースにあります。例外は細菌など。新規の遺伝子であれば、頑張る理由もあります。既知の遺伝子であれば、「何が発現しているか」がわかれば、後は「お願いしてクローンをもらう」ようにしてます。

(無題) 削除/引用 No.10564-27 - 2022/08/04 (木) 08:48:13 - おお ん？

クローニングするということは、、 削除/引用 No.10564-26 - 2022/08/04 (木) 07:13:33 - m クローニングするということは、その後、採った遺伝子を発現させて、機能を見るということが重要かと、、、 新規の遺伝子の場合、速くやることも大事ですが、効率よく、遺伝子の読み間違えを少なく、遺伝子発現に持っていく系が重要では？例えば、いきなり発現ベクターにクローニングすれば、相当仕事量を減らせます。 新規の遺伝子でない場合、既知の遺伝子の中から、どれが発現しているかを調べることが、重要かと。それなら、特異的プライマーのPCRで十分。 ・・・遺伝子がわかれば、全長cDNAはどこからか入手可能と思います。遺伝子が長い場合、自分でPCR増幅させると変異が入ることが多いのでは。 発現している遺伝子に変異、ポルモリフィズムを期待しているのであれば、直接シークエンスがよいのでは？ 話の筋が少しずれたかもしれません。遺伝子発見であれば、遺伝子一つでいい論文になる。数をやるより、歩留まりを上げる方が良いように思います。既知の遺伝子であれば、私ならPCRです。

(無題) 削除/引用 No.10564-25 - 2022/06/25 (土) 00:05:17 - おお >[Re:24] 利害無関係者さんは書きました : > それはともかくとして、クローニングのステップを経ていないので、PCRのエラーも含めてヘテロな産物になりうるの可能性は常にあることはそのとおりだと思います。 あ、そうそうそういう感じのやつ。追記ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10564-24 - 2022/06/24 (金) 07:33:49 - 利害無関係者 それはともかくとして、クローニングのステップを経ていないので、PCRのエラーも含めてヘテロな産物になりうるの可能性は常にあることはそのとおりだと思います。 シークエンスなどで大部分が望む産物であることが確認できれば、そういうものとして（マイナーなコンタミが存在しうるものとして）以後の実験をデザインするか、この段階で大腸菌に形質転換してクローニングすることになるのでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.10564-23 - 2022/06/24 (金) 07:29:17 - 利害無関係者 下にあるの10断片の連結は「連結のためのキット」のデータなのでラダーになるのは当然では？

(無題) 削除/引用 No.10564-22 - 2022/06/23 (木) 22:40:27 - おお >[Re:17] がさんは書きました : > おおさんがコメントしていた、ヘテロな産物についてですが、 > これまで15種類程度のplasmidをassembleしてきましたが、ヘテロな産物は電気泳動レベルでは全く確認できないです。増幅した産物を大腸菌にトランスフォームしても、ほぼ100%目的産物です。 > 個人的な印象ですが、kitの性能としてはかなり優秀です（コストは高いですが）。 https://oriciro.wixsite.com/oriciro-jp ここの下の方に１０この連結を試みていますけど、１０こ未満の産物ができていてヘテロですよね。 また、おそらくLigationしたようなものも増やせると思いますが、両端同じ酵素のコヘッシブであれば２種類（以上）の産物ができて、自動的にどちらかに偏るのも、ヘテロで増えるのも都合が悪いとかそういうことを考えていたのです。

(無題) 削除/引用 No.10564-21 - 2022/06/23 (木) 22:29:42 - おお >[Re:20] TOKIOさんは書きました : > https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cloning/topo/topo-ta-cloning/topo-ta-with-mach1-competent-cells.html > > mach1速すぎて使いにくい印象もありました笑 > が目的には合致しますか？ そうそう、朝TFして夜にミニプレップ用の培養を始めるのであれば増殖が速い菌株を使ったほうがいいと書こうと思っていて忘れてました。

(無題) 削除/引用 No.10564-20 - 2022/06/23 (木) 21:54:27 - TOKIO https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cloning/topo/topo-ta-cloning/topo-ta-with-mach1-competent-cells.html mach1速すぎて使いにくい印象もありました笑 が目的には合致しますか？

(無題) 削除/引用 No.10564-19 - 2022/06/23 (木) 16:39:16 - が そうですか、雑すぎましたか。失礼しました。 ところで、Syberさんが質問された答えを得て知識を更新することができましたか？

(無題) 削除/引用 No.10564-18 - 2022/06/23 (木) 13:28:51 - SYBR master >おおさん、利害無関係者様、 情報ありがとうございました、自分の中の知識を更新しておきます。 >[Re:17] がさんは書きました : > >Syberさん > kitで増幅できるから、大腸菌では増えないのでは？と考えるのは、どうでしょう。 勝手に私の質問を、あなたの脳内で変な変換しないでください。「OriCが二つあっても増えるのか？」って聞いたんですよ。そして僕の知っている知識では、「増えないと」考えたのです。また使用例で「Kitで再増幅している」所から、増えないから使い勝手が悪いと判断したんです。 なので >間違えてます。できます このエビデンスが付属していない情報では、更新できないのですよ、雑すぎて。

(無題) 削除/引用 No.10564-17 - 2022/06/23 (木) 09:15:04 - が >Syberさん oriciro何度も使用経験があってのコメントです。 大腸菌で増えます。 kitの目的は大腸菌クローニングから開放することを謳っていますので、kitで増幅させています。 kitで増幅できるから、大腸菌では増えないのでは？と考えるのは、どうでしょう。 おおさんがコメントしていた、ヘテロな産物についてですが、 これまで15種類程度のplasmidをassembleしてきましたが、ヘテロな産物は電気泳動レベルでは全く確認できないです。増幅した産物を大腸菌にトランスフォームしても、ほぼ100%目的産物です。 個人的な印象ですが、kitの性能としてはかなり優秀です（コストは高いですが）。 個人的には、かなりの頻度でplasmid constructionしていますが、殆どの場合が従来法の大腸菌を利用したクローニング方法でおこなっています。 トピ主のリクエストは、クローニングのスピードアップですが、その目的でoriciroは使っていません。コストが問題です。oriciroを使うのは、作製の困難な場合、断片が多い場合、サイズが大きい場合など、なにか特殊な理由がないと使っていません。

(無題) 削除/引用 No.10564-16 - 2022/06/23 (木) 08:10:55 - 利害無関係者 コピペをしくじりました。 However, when you combine with a high-copy pUC origin, then oriC will inhibit E. coli growth. です。

(無題) 削除/引用 No.10564-15 - 2022/06/23 (木) 08:09:15 - 利害無関係者 パンフのFAQにもこうありました。 Q6 : Could a circular plasmid contains both oriC and another E. coli replication origin? A6 : Basically, oriC does not interfere with the function of the other plasmid origin like ColE1, p15A or R6K even if it were combined. However, when you combine with a high-copy pUC origin, then oriC will inhibit E. coli gi growth. Also, another plasmid origin does not interfere with the in vitro amplification.

(無題) 削除/引用 No.10564-14 - 2022/06/23 (木) 07:36:38 - 利害無関係者 大腸菌中でもoriC依存的に複製されるようですが、ultra low copyでしょうね。 https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjg/66/1/66_1_85/_article/-char/ja/

(無題) 削除/引用 No.10564-13 - 2022/06/23 (木) 04:11:43 - おお >[Re:12] SYBR masterさんは書きました : > >[Re:11] がさんは書きました : > > > > >これって、大腸菌のOriCを組み込んでないと増幅出来ないので、作成できたplasmidは二度と大腸菌に形質>>転換できないと思うんだけど、何か私間違えてる？OriCを持つ２種類のDNAて大腸菌で存在できるの？ > > > > 間違えてます。できます > > なら、なんで再度増やすとき、同じキット使っているの？ > できるなら、その根拠となる論文も、教えてください。 https://oriciro.wixsite.com/oriciro-jp ここの真ん中からちょっと下のあたりに 「増幅産物は大腸菌への形質転換が可能」 とは書いてますが、わたしも文献など詳細が知りたいですね。pUC Oriなどの入ったプラスミドに組み込んで最終的にできたものは大腸菌内でpUC Oriで維持できるとか言う話なんでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.10564-12 - 2022/06/22 (水) 23:59:59 - SYBR master >[Re:11] がさんは書きました : > > >これって、大腸菌のOriCを組み込んでないと増幅出来ないので、作成できたplasmidは二度と大腸菌に形質>>転換できないと思うんだけど、何か私間違えてる？OriCを持つ２種類のDNAて大腸菌で存在できるの？ > > 間違えてます。できます なら、なんで再度増やすとき、同じキット使っているの？ できるなら、その根拠となる論文も、教えてください。

(無題) 削除/引用 No.10564-11 - 2022/06/22 (水) 20:10:17 - が >これって、大腸菌のOriCを組み込んでないと増幅出来ないので、作成できたplasmidは二度と大腸菌に形質>>転換できないと思うんだけど、何か私間違えてる？OriCを持つ２種類のDNAて大腸菌で存在できるの？ 間違えてます。できます

(無題) 削除/引用 No.10564-10 - 2022/06/22 (水) 18:21:51 - SYBR master >[Re:4] 利害無関係者さんは書きました : > こんなのは？ > https://oriciro.wixsite.com/oriciro-jp これって、大腸菌のOriCを組み込んでないと増幅出来ないので、作成できたplasmidは二度と大腸菌に形質転換できないと思うんだけど、何か私間違えてる？OriCを持つ２種類のDNAて大腸菌で存在できるの？

(無題) 削除/引用 No.10564-9 - 2022/06/21 (火) 21:57:13 - おお >[Re:4] 利害無関係者さんは書きました : > こんなのは？ > https://oriciro.wixsite.com/oriciro-jp 面白いけど、できたものがヘテロな集団であったりするかもしれないという所が気になる点だ。

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