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(無題) 削除/引用 No.1054-5 - 2012/10/25 (木) 18:09:09 - KY 他の方がおっしゃっている通り、グリセロールストックの凍結再融解はタンパク質発現にはよくないと聞いたことがあります。 なので、僕は100ulづつのグリセロールストックを必要本数作成し（もちろん増殖のよい状態で保存したもの）、毎回100ul全部を培養液に突っ込み、タンンパク質発現の実験をしていました。 シングルコロニーから毎回行うのとどっちがよいのかは、比較したことありません。

(無題) 削除/引用 No.1054-4 - 2012/10/25 (木) 09:27:11 - ~ アルカリSDS法でプラスミド抽出 ↓ そのプラスミドを用いて大腸菌をトランスフォーメーション （その際にヒートショックを行った？） ↓ グリセロールストックを作製し、発現を確認 ↓ そのストックを使い続けていたら、発現が落ちた？ という状況なのですよね。 ストック作製後に発現を確認できていた以上、その前の段階のプラスミドの精製具合は影響していないと考えていいでしょう。 それよりも、基本的にたんぱく質発現株は長期保存はできないと考えて、実験系を作った方がいいでしょう。 ただ、確認できている結果は、「大腸菌内（外？）の目的たんぱく質量の低下」ですか？ それとも、「精製後のたんぱく質量の低下」ですか？ 精製前の段階で、たんぱく質量は比較されたのでしょうか？ どのステップに問題があるかを確認しないと、問題のないステップにも力を注ぐことになってしまいます。 例えば今回のケースで精製後のたんぱく質量しか見ていないとしたら、精製用のバッファーやビーズに不具合があっても、同じ結果になりうるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1054-3 - 2012/10/25 (木) 01:25:40 - おお APさんが仰るようにお示しの実験の手順など、不明なところが多々ありますのでまずは具体的に何をされたか説明をお願いしたいところであります。 グリセロールストックについてはAPさんが書かれているように保存に伴い徐々に発現が落ちていく傾向にあります(これもAPさんが説明しています) HISTAGがニッケルカラムにつきにくい件は、もしかしたら改善の余地があるかもしれません。これもここで度々議論がされています。 手順などわからない状態で想像でPEGチンが影響するかどうかという点でこたえると、多分影響しないだろうとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1054-2 - 2012/10/24 (水) 20:45:59 - AP >うっかり大腸菌にヒートショックしたものをグリセロールストックとして以降発現確認を行っておりました。 選択培地で選択して単離したクローンを殖やしたものをストックするもんですよね？　なぜそのような方法をとったのか、理由はあるのでしょうか。ただのうっかりですか？ >最近になってPEG沈したらプラスミドがきれいになって発現量も増加するのでは（もしかしたらアフィニティー精製もうまくできるのでは）と思ってPEG沈を含めたプロトコールに従ってやり直している状態です。 PEG沈しようとしまいと、大腸菌に入ってしまえば一緒でしょう？ どうして、そういう発想になったのか、筋道建てて説明がほしいところです。 >初めの頃は問題なく発現していたのですが（ただ、Hisタグでアフィニティー精製しにくい、吸着が弱い？）最近発現量が落ちてきていて よくあることでしょう。過去トピ（古い掲示板だと思う）にもあったと思います。それによると、 普通はグリセロールストックを、その都度画線培養して単離したシングルコロニーをo/n培養して、それをスケールアップするのが常法だと思っていますが、 、、、 そういうことが起こるので、シングルコロニーを培養したものを分注してグリセロールストックにしておいて、その都度、一本をそのまま大規模培養の種にするという人もいると記憶しています。

PEG沈の有無で発現量変わる？ 削除/引用 No.1054-1 - 2012/10/24 (水) 19:48:09 - b はじめまして、大腸菌関連で投稿させていただきます。 アルカリプレップで精製したプラスミドなんですが、先輩から確認だけならPEG沈は必要ないと言われてその流れで、うっかり大腸菌にヒートショックしたものをグリセロールストックとして以降発現確認を行っておりました。 初めの頃は問題なく発現していたのですが（ただ、Hisタグでアフィニティー精製しにくい、吸着が弱い？）最近発現量が落ちてきていて冷凍庫（-80℃）からの出し入れによる凍結融解の影響かなと思い、再度グリセロールストックを作製しました。 最近になってPEG沈したらプラスミドがきれいになって発現量も増加するのでは（もしかしたらアフィニティー精製もうまくできるのでは）と思ってPEG沈を含めたプロトコールに従ってやり直している状態です。 実際、PEG沈の有無による収量の変化はあるのでしょうか。 ご存知の方いらっしゃいましたらよろしくお願い致します。

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