お世話になっております。
皆様、たくさんのご指摘やアドバイスをくださり、本当にありがとうございます。
コロニーPCRまで行い、インサートが挿入されていることが確認できましたので、報告いたします。
皆様のアドバイスをもとに、次のような条件を振りました。
・UV照射: いつも通り or 一切当てない
・infusion反応条件: 50℃, 15 min or 45℃, 30 min
・形質転換液量: 3 μL or 10 μL
今回の実施にあたり、作成したいinsertが2種類（以下A, Bとします）ありましたので、両方で上記条件での検討を行いました。
UV照射群と非照射群について、照射群ではすべての条件で一切コロニーが観察されませんでしたが、非照射群ではいずれの条件でもコロニー形成が認められました。
（一番少ないもので100個ぐらい）
indusion反応条件について、インサートA（1000 bpsぐらい）では条件による差は認められませんでしたが、インサートB（2000 bpsぐらい）では45℃, 30 minのほうが1.5倍ほど多くのコロニーが観察されました。
形質転換液量について、3, 10μLで差は認められませんでした。
以上の結果から、私の条件ではUV照射が非常に強く影響していたようで、インサートによっては45℃, 30 minのほうが効率が良いこともある、ということがわかりました。
今回使用していた菌株が組み換え酵素欠損株であり、またこれまで使用していたプラスミドよりも鎖長が長かったこともあり、UVによるDNA損傷の影響が強く反映されていたものと考えております。
参考にしたトピックがありましたので、以下に示します。
ttp://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=3893
また、皆様から頂いたご指摘の中で、ゲル抽出を避けることや培養温度を下げること、inversePCRによる開環などは実施しておりませんでしたので、今後のクローニングで詰まることがありましたら、是非試してみようと思います。
改めてご指導してくださった皆様に御礼申し上げます。
ありがとうございました。 |
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