ラボに配属されて半年ほどの学部生です。
プラスミドのクローニングについての質問です。
pCW57.1にinfusion法でインサートを組み込みたいのですが、トランスフォーメーションまで行ってもコロニーが得られず、難航しています。
プロトコルは以下の通り実施しています。
【インサートの調製】
（すでにインサート部分のクローニングには成功しており、別のベクターに組み込まれている状態です。）
1. infusion用の配列を付加したプライマーでPCR増幅
PCRはKOD-Plus Neoで25 cycle
2. PCR反応後の液をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的の位置のバンドを切り出し（バンドが2本見えるためゲル精製）
3. Promega Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up Systemで精製
4. 50μL MQで溶出
5. 一部をアガロースゲル電気泳動に流し、DNA濃度を確認
（プライマーの配列が間違えていないことは、2人の先生に確認してもらっている）
【ベクターの調製】
（addgeneで購入したものを増幅済み, 本来gateway法で実施するようの配列が組み込まれているが、wet系のラボの先生からのおすすめでinfusion法で実施している）
1. plasmid DNA 1μgに対して、Nhe-1 HF, Age-1 HFで同時に切断 37℃, 15-60 min (15, 30, 60 minで検討済み。いずれの時間でも切断できているようで、バンドパターンは15-60 minで変化なし)
2. 切断したプラスミド、未切断のプラスミドを全量電気泳動
3. 目的の位置のバンドを切り出し
4. インサートの調製と同様にゲル精製
5. 一部をアガロースゲル電気泳動に流し、DNA濃度を確認
【infusion反応】
1. vector : insert = 1:1, 1:3, 1:5 となる条件でinfusion（全量で5μL）
（vector量は25, 50 ngで検討済み）
2. 50℃, 15 minで反応
【コンピテントセルへのtransformation】
（コンピテントセルは自作のもの（stbl3株）を使用、コンピテンシーについては1×10^8 cfu/μgであることを確認済み, 100μL/tubeで分注）
1. コンピテントセルを-80℃から取り出し、氷上で穏やかに融解 (15 min程度）
2. コンピテントセルに対して、1 or 3μLのinfusion反応液を添加
3. 氷上で10分静置
4. 42℃, 45秒
5. 氷上で10分静置
6. SOC培地を500μL添加
7. 37℃, 200rpmで30分振盪培養
8. 遠心分離, 1000 g, 3 min
9. 100 μL LB液体培地に再懸濁
10. 全量をLB培地（100 μg/mL Amp含有）に播種
11. 37℃, 12-16時間
12. 結果観察（infusionキット付属のポジティブコントロールではコロニーが100個ぐらい生えていることを確認）
infusionをおすすめしてくれた先生にもいろいろと聞いて試しましたが、一向にコロニーが得られません。
どこを改善したら良いのかわからない状況です…
プラスミドに組み込んだ配列が大腸菌にとって毒性を示している可能性も考えましたが、他のベクターではコロニーが得られていることから考えにくいと思っています。
また、ラボはdry系のラボで、共通機器室で実験しているためノウハウがありません。
長々と書いてしまいましたが、どなたかご教授いただけないでしょうか。
何卒よろしくお願いいたします。 |
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