全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

コメント、ありがとうございます。 削除/引用 No.10528-13 - 2022/06/15 (水) 11:28:10 - TOM デジタルPCRもありましたね。 ご指摘、誠にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10528-12 - 2022/06/14 (火) 11:53:13 - が >ちなみに、qPCRよりも精度高くコピー数を算出できる手法は、現時点ではNGSのみでしょうか？ Droplet digital PCRはもっと精度でいえば、betterですよ。

コメント、ありがとうございます。 削除/引用 No.10528-11 - 2022/06/14 (火) 11:24:04 - TOM 諸々、コメントありがとうございます。 まっすぐな検量線が引けるということの難しさについてですが、 現実的にR^2=1になることは、ほぼ無いかと思います。 6点検量線でいえば、よくて0.999までが限界な印象です。 この難しさが非常に厄介で、僅かなズレが検量線の近似式に影響し、 それが算出されるコピー数に大きく影響してきます。 そうなると、「真の値は何なんだ？」といった状態になってしまいます。 算出時に検量線を用いないCt法だと、上記のような悩みがなくなることから、 見かけ上は「ブレが少ない」結果になることもあるかもしれませんが、 どちらが真の値に近いのかは、実験系や実験者、測定機器の精度等、 多くの要因で変動してくるものと想像しています。 これらを加味した上で、qPCRでは、どれほど精度高く、コピー数の算出ができるのかな、と考えているところです。 ちなみに、qPCRよりも精度高くコピー数を算出できる手法は、現時点ではNGSのみでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10528-10 - 2022/06/14 (火) 10:19:54 - seventh 訂正 CTについてはターゲットと増加に伴って減少ですね。

(無題) 削除/引用 No.10528-9 - 2022/06/14 (火) 10:04:59 - seventh dCT法は理想条件（ターゲット2倍につきCTがX（=1）増加）を想定しているので、ズレが小さく見えるのは普通なのでは。 そもそもdCTが使えるのは、まっすぐな検量線が引けることが前提なので考え方が逆な気がしますが。

(無題) 削除/引用 No.10528-8 - 2022/06/14 (火) 00:45:49 - おお 絶対定量と、Ct値を使った相対定量は全く別物ですし単純な比較はどうなのかと思いますが、絶対定量は試薬調製、スタンダード調製のブレの影響をもろ受けるけど、dCtでの評価はサンプル内でブレが補正できるので正確に見れることがあるってことでしょうかね。 検量線用の溶液は一度作って保存しておくてはないのでしょうか。

コメント、ありがとうございます。 削除/引用 No.10528-7 - 2022/06/13 (月) 15:56:29 - TOM Ct法の方が、検量線による絶対定量よりも再現性が高いというのは、異なる反応系においても同様なのでしょうか？ 仮に、検量線用の希釈系列を用時調整せず、全く同一の核酸溶液を使用したとしても、同様に再現性が高くなるものでしょうか？ 諸々、ご質問ばかりで恐縮ですが、大変興味深く拝見しました。

検量線法のバラつき 削除/引用 No.10528-4 - 2022/06/11 (土) 13:20:24 - Dohn Joe dCt法の方が検量線による絶対定量よりも測定の再現性が高いことが最近興味深く感じられて色々検証してみました。 おそらく、検量線法は用事調整の希釈系列を作るところがRUNによる違いの最大の原因です。このことを傍証するのが次に述べる観察結果です。同じcDANを違うRUNで測った場合にCt値が0.1ぐらいしかぶれませんが、再測定して得た検量線の方は結構違います。この部分を解決したら数パーセントぶれるぐらいのところに収まると思います。

コメントありがとうございます。 削除/引用 No.10528-3 - 2022/06/10 (金) 12:57:52 - TOM 1.2倍以内でおおよそOkとのことですね、ありがとうございます。 とても参考になります。 また、参考文献もありがとうございます。 拝読いたします。

(無題) 削除/引用 No.10528-2 - 2022/06/09 (木) 15:11:21 - おお https://static.thermoscientific.com/images/D21499~.pdf RT-qPCR の例。 ぶれ幅から大体１.２倍くらいの範囲かなと。大昔発現比較している人に聞いたら、１.２倍ならうまくいけばみれるかなっていってた。 Uvは特異的な配列のDNAを測れるわけではないけど、精製したプラスミドやオリゴをはかるなら、ピペっティングのぶれがそのまま反映されるくらいの精度ではないかな。そもそも１回測れば十分で、３かい計って平均とって精度を上げる必要ない。

qPCRによるdsDNAの絶対定量の精度 削除/引用 No.10528-1 - 2022/06/09 (木) 14:26:12 - TOM qPCRによる定量精度についてのご質問です。 現在、dsDNAの定量をPCRにて実施しております。 蛍光はSYBRです。 検量線は、10^9〜10^2copy/wellの希釈系列を作成し、 得られた検量線からサンプルのコピー数を算出しております。 理論的には、得られた検量線から正確なコピー数が分かるかと思いますが、 実際は、同じサンプル・同じ試薬を使用してqPCRしても、 RUNごとに得られる結果が、若干異なってくるかと思います。 原因としては、 ・手技手法（ピペッティング操作等）の誤差 ・チューブ等へのDNAの吸着 ・PCR装置の感度 などが挙げられるかと思いますが、これらを加味したとして、 どれほどの精度で定量できるものでしょうか。 qPCR法以外の核酸定量法として、分光光度計による測定やNGS解析などが 有るかと思いますが、それらと比較して、どれほどの定量精度があるのか、 実際にデータを扱っている方々のご意見を伺いたく、思っております。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---