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(無題) 削除/引用 No.10524-17 - 2022/06/13 (月) 15:37:51 - くー 解決しました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10524-16 - 2022/06/13 (月) 15:32:36 - まる cDNA合成の原理しか知りませんでした。 ありがとうございます。理解できました。

(無題) 削除/引用 No.10524-15 - 2022/06/13 (月) 15:23:26 - G25 ここで話題にしているのは、RNAを鋳型にして逆転写してできるDNA、いわゆる1st standのことだから。1st strandは二重鎖DNAではない（なにも処理しなければRNA:DNA　ハイブリッドではあろうが）。さらに1st stardを鋳型にして相補鎖（2nd strand)を合成すると初めて二重鎖cDNAになる。 普通のRT-PCR目的であれば1st strandまでしか合成しないのが一般的。 その後、RNAを酵素などで分解除去すれば完全な一本鎖DNAになるし、熱変性すれば一本鎖DNAとRNAの混合物になるかもしれないし、なにもしなければRNA:DNAハイブリッドの状態かもしれない。いずれにせよ二重鎖DNAにはならない。 ただし、今回のケースだとssDNA用試薬を使っても、インプットのRNAも光ってしまうので適切な定量はできないだろう。

(無題) 削除/引用 No.10524-14 - 2022/06/13 (月) 14:58:51 - まる すみません、cDNAは相補的、すなわちdsDNAではないのでしょうか。 なぜss DNA用の測定キットを用いるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10524-13 - 2022/06/07 (火) 15:05:31 - G25 れれ、dsDNA用の試薬なんですか。 じゃあ、濃度が低く出てもさもありなん。 逆転写反応のやり方によっては産物はRNA-DNAのハイブリッドだし、 なにを測っているのかよくわからんことになります。

(無題) 削除/引用 No.10524-12 - 2022/06/07 (火) 14:32:31 - G25 蛍光色素だとdNTPの干渉はないにしてもRNAや遊離のprimerも測ってしまうけれど、ちゃんとcDNAだけの濃度測定になるようにしてあるのかな（RNase処理とかカラム精製とか）。 あと、RNA濃度は反応液に加える前の原液を測っていると思うけど、逆転写反応に加えて希釈されているのを考慮した上で、cDNAの濃度との比率を出しているのですよね。

(無題) 削除/引用 No.10524-11 - 2022/06/07 (火) 14:31:48 - くー 本当ですね… 大変基本的なことを失念しておりました。 ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10524-10 - 2022/06/07 (火) 14:23:42 - TS dsDNAではそりゃダメでは。。。

(無題) 削除/引用 No.10524-9 - 2022/06/07 (火) 14:09:56 - くー ご指摘ありがとうございます。 QuibitのdsDNA用のキットを用いています。 吸光度ではなくて蛍光ですね…失礼いたしました。

(無題) 削除/引用 No.10524-8 - 2022/06/07 (火) 14:03:39 - TS あ、ちらっと読んだら違いました。核酸なら引っかかるらしい。 The Qubit ssDNA kit is ideal for quantitating single-stranded DNA or oligonucleotides. However, it is not specific for single-stranded DNA. This assay kit will also detect double-stranded DNA and RNA,

(無題) 削除/引用 No.10524-7 - 2022/06/07 (火) 14:01:29 - TS QuibitのssDNA用のキットを使っているのですか。 吸光度ではなくて蛍光じゃないかと思うのと、あれはssDNAに特異的では？ Overestimateはないような。

(無題) 削除/引用 No.10524-6 - 2022/06/07 (火) 13:48:05 - くー 濃度測定はQubitを用いています。 吸光度を原理としているキットですので、G25様が仰るようにover-estimateになってこの濃度であれば尚更問題ですよね…

(無題) 削除/引用 No.10524-5 - 2022/06/07 (火) 13:37:10 - G25 ちなみに濃度の測定方法は？ 吸光度だともともとあるRNAとか基質として加えたdNTPが干渉するのでcDNAの濃度を測るのは難しいですが（とはいえover-estimateになるはずなので異常に濃度が低いというのとは合わないけれど）。

(無題) 削除/引用 No.10524-4 - 2022/06/07 (火) 13:32:36 - くー ご回答ありがとうございます。 >oligo dTプライミングで20%くらい、random プライマーで50%くらいいけば上出来とされていました。 そこまで濃度は減るのですね、知りませんでした。 測定方法はTaKaRaのキットを用いてプロトコル通りに行っております。 プライミングはoligo dTプライミング、random プライマーを同量、両方入れています。RNAはtotalです。 私の手技の問題かもしれませんね… タッピングのし過ぎで酵素が失活したり、逆に上手く混ざっていないのでしょうか…

(無題) 削除/引用 No.10524-2 - 2022/06/07 (火) 12:51:43 - G25 >RNA濃度とcDNA濃度がほぼ同じになるのは理想論で ほぼ同じになんかならないと思います。 cDNAライブラリー構築のときは逆転写効率を測定して（RIヌクレオチドを少量混入して取り込み効率を測る）順調に進んでいるかどうかをモニターするものでしたが、 oligo dTプライミングで20%くらい、 random プライマーで50%くらい いけば上出来とされていました。 oligo dTなんかだと調子が悪ければ10%とか。 流石に1% （100倍薄い）は低すぎですが、 測定方法（どうやってますか）や反応系(プライミングはRandomでしょうか、RNAはtotalですよね）に問題があるのでは

逆転写　cDNA　収量 削除/引用 No.10524-1 - 2022/06/07 (火) 12:26:51 - くー 超初心者です。 刺激下細胞からRNA抽出→RNA濃度測定→逆転写→cDNA濃度測定をしています。 原理としては、RNA濃度とcDNA濃度がほぼ同じになるのが理想かと思います。 しかし、RNA濃度に比べ、cDNA濃度はなぜか100倍くらい薄くなってしまいます。 可能性として逆転写の失敗を考え、逆転写最中におけるRNA分解酵素の混入、酵素の失活に注意して行ってみましたが駄目でした。 RNA濃度とcDNA濃度がほぼ同じになるのは理想論で、現実ではこのくらい薄くなってしまうものなのでしょうか。 それとも何かほかに原因があるのでしょうか。 お答えいただけると幸いです。 宜しくお願い致します。

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