>抗体 指定通りの希釈 overnight
overnightは場合によってかなりバックグランドがでます。１時間程度で試されたことはありますか？
>みんな自分の興味のある部分だけ切り取りをしているのでしょうか？
興味があるというと語弊がありますが、リン酸化、非リン酸化合わせて検出できるような抗体でバンドがでなければ、特異的ではないと言う判断はしていいと思います。メインの図にはそこを抜き取るのは構わないと思いますが、ゲル全体を見せろという指摘も来る可能性もあると思いますので、リン酸化特異的な抗体とそうでない抗体のゲル全体のイメージを図にしておいて判断根拠がわかりやすいようにしておけばいいでしょう。その他KDなどで特異的バンドを示すのはありかと思います。またはリン酸化、非リン酸化両方を認識できる抗体でIPしてみるのもありかもしれません。特異的なバンドだけを出すための改善をするにしても、どれが特異的なのか把握していないといけないだろうし。
ラダーが出ているのはリン酸化が複数箇所あるという可能性がありませんか？そういうたんぱくはいくつかあります、Rbとか。あるいはユビキチン化しているのだろうか。
＞10-20秒以内に検出できない場合、いい結果が出たためしがありません。2ndでwashしすぎるとSN比が悪いイメージがあるので、washしすぎないようにしていたのですが。
わたしは普通は思いっきり洗う派ですけどね。とにかく抗体は薄めにしようとする派でもあります。HRPによるバックグランドの発光レベルが検出器の検出限界付近、それ以下なら、必要なバンドのシグナルが多少弱くても、SN比は改善されるはずですね。10-20秒以内ということはケミルミの発光持続時間が短いやつを使っているのでしょうか。あと載せるタンパク量、Lysateをどのように作るか（徹底的にたんぱくを溶出させるか、Tritonだけでマイルドな溶出をするか、Fractionation をするかなど）でもけっかがちがってきます。
リン酸化特異的抗体はあまりやらないのでそういうもの独特の扱いにくさについてはわかりませんけどね。もしかしたらPBSTを使ってみたら非特異的なInteractionがりん酸でブロックされるかも（普通は避けるとされていますけど）。
わたしのWBのバッファーは塩濃度的には１.２倍でTweenは０.２％にしています。ブロッキングはPVPを使ってます。 |
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