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(無題) 削除/引用 No.10517-3 - 2022/06/04 (土) 15:31:27 - GOI ＞み様 コメントありがとうございます。 リポフェクションでの発現持続は概ね説明書きの通りなのですね。 AAV 濃縮液は細胞に添加して2日間交換せず、その後2日おきに全量培地交換をしました。 無交換の間、経時的に傾向を観察すると蛍光が日毎に強くなったので ゆっくり入る、というのは間違いなさそうです。 導入後のプラスミドがリポフェクションと同様の転帰を細胞内な辿るならば 培地交換後に徐々に蛍光が落ちそうなものですが、ウェルに残っているAAVの影響なのですかねぇ。

(無題) 削除/引用 No.10517-2 - 2022/06/04 (土) 12:23:55 - み lipofectionだと添加後12時間くらいから発現が観察でき、72, 96時間あたりまで持続しますね。 私の経験ではAAVは添加後48時間では全く光らず72時間で弱く光始め、その後徐々に蛍光強度が強くなります。すくなくとも感染から遺伝子発現までのタイムラグが長い。 うちのホストは非分裂細胞なのと、AAV添加後培養液を完全には交換していないので、蛍光蛋白が蓄積するからなのか、経時的にウイルス感染数が増加するためなのかわ分かりません。 あなたのAAV添加は一過性でしょうか？AAVが培養液に存在しつづければ72, 96・・・168h時点で感染している可能性が否定できません。

リポフェクションとAAV感染で細胞でのGOI持続時間が違う？ 削除/引用 No.10517-1 - 2022/06/04 (土) 05:50:48 - GOI いつも参考にしています。 線維芽細胞に遺伝子導入をする必要があり、導入方法を検討しる過程で観察した表記の疑問についてご示唆いただけるとありがたいです。 線維芽細胞に1週間程度外来遺伝子を過剰発現させる必要があり CMVプロモーター下にGOIを繋いだ過剰発現プラスミド（マーカー:mCherry）を用いたリポフェクション法の中から効率のよさそうな導入試薬を探して条件検討をしていました。 残念ながら、1週間mCherry発現が持続するものがありませんでした。 一般に、エピソーマルに導入された外来遺伝子は細胞内在のヌクレアーゼ活性で除去されるとのことで 本実験でもマーカー発現が2,3 日を天井に失われたため、これを観察したのかなと思いました。 ところが、AAVにパッキングした同じコンストラクトを同一の細胞に感染させると mCherryの発現が1週間以上持続しました。 条件検討としてはめでたしめでたしなのですが AAVで導入した外来遺伝子も細胞内でエピソーマルに発現するはずなのに なぜリポフェクションよりも長く発現が持続するのだろう、という疑問が残りました。 どちらも遺伝子導入は70%コンフルで実施し、観察の間に100%コンフルに達しています。 探し方が悪いのか、ヒントに当たる情報を見出すことができませんでした。 AAV で in vitro の培養細胞に導入した外来遺伝子はなぜリポフェクションより長持ちなのか？ メカニズム面から理解できることがあるのか、ご示唆いただけますと幸いです。

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