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(無題) 削除/引用 No.10510-17 - 2022/06/03 (金) 17:01:43 - 774R 十数残基程度のエピトープタグのように短い配列の可能性もあるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.10510-16 - 2022/06/03 (金) 14:35:35 - G25 Gibson Assemblyだと両端に15 bp程度ののりしろが必要だから それだけで30 ntでしょ。プラス中身の配列となると、いったいどれくらいの長さの「オリゴDNA」を合成したんだろうか？　オリゴどころか人工遺伝子合成だったりして（だったら、アニール済みで納品されるか、、、）。

(無題) 削除/引用 No.10510-15 - 2022/06/03 (金) 09:37:20 - 渚 ここで言う「Assembly」は、「Gibson Assembly」のことでした。混乱させてしまい申し訳ないです。

(無題) 削除/引用 No.10510-14 - 2022/06/02 (木) 15:15:13 - 774R できれば、「Assembly」が何を意味するもんだか答えてもらえるとスッキリするのだが・・・

(無題) 削除/引用 No.10510-13 - 2022/06/02 (木) 10:07:05 - 渚 ×強権→○条件

(無題) 削除/引用 No.10510-12 - 2022/06/02 (木) 10:05:29 - 渚 投稿主です。 たくさんのご指導、ご指摘ありがとうございます。自分自身の学の浅さに恥ずかしい思いでいっぱいですが、おかげさまで新しく知れたことがいっぱいありました。 特に”Primerの結合”だと思って調べても出てこなかったものが、”オリゴDNAのアニール”で調べると多数ヒットして、言葉選びの重要性を学びました。ありがとうございます。 また、手法やプロトコルを送っていただいた方にも感謝です！ぜひ最適な強権を検討していきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.10510-11 - 2022/06/02 (木) 03:18:26 - おお オリゴ注文するときプライマー注文とかいったり、プライマー合成しますとかいう謳い文句だったりでごっちゃになっているかもしれないが、プライマーというのはポリメラーゼが伸長反応するための足場のような役割をするものです（レプリケーションが起こるときにプライミングとかそういった用語が出てくるので見てみるといいでしょう）。 質問のような場合合成したDNAをプラスミドに挿入するのでプライミングするわけではありませんから、プライマーと呼ぶと違和感があります。オリゴDNAなどというほうがいいでしょう。 Assemblyはおそらく一般に言われているLigationの事だと私も思います。アセンブルするわけですけど、このような場合Assemblyとは言いません。Gibson assemblyというのはありますが、これは商品名としての造語でしょう。 どうなんでしょう、複数のDNA FragmentsをGibson assemblyでつなげるとき皆さんはアセンブルすると言っているでしょうか（という素朴な疑問はありますが）？

(無題) 削除/引用 No.10510-10 - 2022/06/01 (水) 16:28:28 - G25 新人さんのせいか、用語が適切でなくて伝わりにくいところがあるんですが、 >Assemblyで目的のinsertを挿入したplasmidを作製しようとしています Assemblyってなんでしょう。Gibson assemblyのようなこと？ だったらライゲーションもリン酸化も関係なくなるわけですけど。 それとは私が無知なだけでAssemblyといえばアレってすぐに通じるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10510-9 - 2022/06/01 (水) 16:23:29 - 774R 思い出したので追記。 インサート側をリン酸化すると、インサート同士のライゲーションが起こり、タンデムでインサートが入りがちです。この場合は、インサートの希釈率が重要になる。インサートチェックはクローニングした制限酵素ではな、大外で切る酵素でタンデムインサートじゃないことを確認。

成功率の高い方法 削除/引用 No.10510-8 - 2022/06/01 (水) 16:17:44 - 774R どのようにligationするか書かれてませんが、平滑末端もしくは単一の制限酵素切断端で行おうとする場合、ベクターのセルフライゲーションを防ぐために脱リン酸化が必要です。逆にインサートとなる方はリン酸化が必要になります。インサートのリン酸化の代わりに、オリゴの末端に制限酵素サイトを付加して、制限酵素処理することでリン酸化済みの末端を形成することも可能です。 以下は、経験上、成功率の高い方法。 ベクターは2種類の制限酵素で処理する。（脱リン酸化不要でセルフライゲーション回避） インサートとなるオリゴがアニールすると上記の制限酵素付着末端が生じるようにオフセットしておく。 インサートは通常のオリゴ合成だと物凄い濃いので、数千倍から数万倍希釈してベクターと混ぜてligationする。

(無題) 削除/引用 No.10510-7 - 2022/06/01 (水) 15:17:29 - G25 細かいことだけど、一応、指導を入れときます。 こういうのは「結合」ではなく「アニール」というのがふさわしい。 あとprimerとして使うわけじゃないからprimerとかLとかRとか呼ぶのはおかしいね。「相補な合成(オリゴ)DNA」とか他にふさわしい呼び方がある。

(無題) 削除/引用 No.10510-6 - 2022/06/01 (水) 15:09:28 - G25 >PrimerとH2Oを入れて、95℃までサーマルサイクラーで加温してから徐々に下げていく形で問題ないでしょうか。 いろいろな流儀がありますが、それでも構いません（そういうふうにやる人もいます）。 よりよい条件にするならバッファーしておいたほうがいいだろうし、塩濃度を上げておいたほうがいいですが、ダウンストリームの使い方にもよります。酵素反応のためにEDTAは入れないほうがいいだろうし、塩で干渉される反応なら塩は入れないほうがいいかもしれない。オリゴDNA自体が溶液を酸性化して安定性を悪くする恐れがありますから、10 mMくらいのTrisバッファーにでもしておくといいと思います。 サーマルサイクラーのプログラムで徐々に温度を下げるのもいいですが、古典的には、ウォーターバスかドライバスで95℃くらいに加熱した状態から、電源を切って一晩くらい放置して自然に冷ましてやるものでした。短いDNAだろうし濃度も濃いだろうからアニール速度は速いはずですが、プログラムであわくって冷ますより、自然冷却でゆっくり冷ましたほうが効率が良さそうな気がする。

(無題) 削除/引用 No.10510-5 - 2022/06/01 (水) 14:44:45 - み >[Re:2] nonameさんは書きました : > ヒント：リン酸化 vector側にあれば大丈夫ですよね？

(無題) 削除/引用 No.10510-4 - 2022/06/01 (水) 14:43:07 - み TEまたはTE+100mM NaClでやっておいたら良いかな。 ２分くらいHeat blockでボイルして電源切って徐々に冷めるのを待つか、PCR95℃２分したあと90, 87, 84, 79・・・・と10秒ずつ下げていったら速くできる。 先生に聞いてからやった方が良いよ。

(無題) 削除/引用 No.10510-3 - 2022/06/01 (水) 14:36:29 - おお https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/annealing-oligonucleotides です。

(無題) 削除/引用 No.10510-2 - 2022/06/01 (水) 14:35:16 - noname ヒント：リン酸化

プライマー(核酸)同士を結合させたい 削除/引用 No.10510-1 - 2022/06/01 (水) 14:09:11 - 渚 学部4年生です。 いまVectorを制限酵素で消化して、Assemblyで目的のinsertを挿入したplasmidを作製しようとしています。そのinsert側として、相補鎖の関係になっているFとRのPrimerをデザインしました。 これらのPrimer同士をくっつけてinsert側を完成させたいのですが、温度条件や試薬条件など、どのようなことを行う必要があるでしょうか。 PrimerとH2Oを入れて、95℃までサーマルサイクラーで加温してから徐々に下げていく形で問題ないでしょうか。

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