全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1049-10 - 2012/10/25 (木) 21:18:27 - qq >培養細胞にGST融合タンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトし、 で、発現している証拠をどのようにとっているのでしょうか？ >今まで試したGSTタグ抗体はどれも結合活性が低く、ぼけたバンドしか出ません。 ボケたバンドは、293の内在性のGSTを交差反応している可能性はないですかね？ トランスフェクトしないと何もバンドはでませんかね？ 例えば、大腸菌の内在性のGSTは、グルタチオンセファロースに幾らか結合しますが、良いSchistomaGST抗体であれば殆ど検出されなくて、Schistomaの組み換えGSTのみが検出されます。普通使っているGSTは、ジストマのGSTです。それぞれの市販抗体は、交差反応しないことが保証されているとは限りません。

(無題) 削除/引用 No.1049-8 - 2012/10/25 (木) 00:02:05 - ab データシートを見てみると、和光の抗体は293細胞のlysateできれいに出ているみたいですね。 293細胞だと発現量が異常に多いというのもきれいに見える理由かもしれませんが、何かポジコンはないのでしょうか。 きれいに見えないのは単に発現量が少なすぎるような気もしますが。 もしくは、融合したタンパク質のせいかもしれません。 1.　293細胞などの高発現できる細胞を使う 2.　GSTのみを発現させる ということは試したのでしょうか。 また、バンドがボケるのは抗体の問題より泳動の問題のようにも思えます。 他のタンパク質の検出は上手くできていますか？

抗体と感度？ 削除/引用 No.1049-7 - 2012/10/24 (水) 23:41:11 - ゴーゴン 　ウェスタンでの検出方法は何ですか？ 抗体の特異性と検出感度がごちゃ混ぜになっているような気もします。 　使えなかったとされる抗体でも、１次＆２次抗体濃度を変え高感度検出試薬を使えば、バシッとONEバンドで見えてくるのでは？ 　メーカーによって抗体の希釈倍率も変わってくるので、色々な濃度で試されていますか？ 　Can Get Signalみたいのを購入してみるのは？ 　モノクロだからボヤっとしていて、ポリクロは少しマシだった・・ポリクロはGSTに結合できる１次抗体が多いから・・・だったら次の抗体候補もポリクロから選ぶべきでしょうね 　以上、思いつくままに書いてみました。

(無題) 削除/引用 No.1049-6 - 2012/10/24 (水) 06:13:27 - おお https://store.crpinc.com/datasheet.aspx?Catalogno=MMS-112R ちなみに大腸菌リコンビナントで使っているのはこれです。

(無題) 削除/引用 No.1049-5 - 2012/10/23 (火) 22:23:47 - qq GEのGST融合タンパク質検出キット（結構なお値段）の抗GST抗血清（ヤギ）をどうにもこうにもバックが高いので、GSTを固定化したアフィニティーカラムで精製すると大変良好な抗体が得られました。 キットの抗血清を失ってしまうかもしれないけれどやってみる蛮勇と、抗体をアフィニティー精製するあるていどの技術が必要です。 >培養細胞にGST融合タンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトし、 なのですね。そのような条件では確認していませんので、あしからず。

(無題) 削除/引用 No.1049-2 - 2012/10/23 (火) 14:30:43 - おお それ以外で使っている抗体はあるのですが、バクテリアで発現して使ってますので、真核生物の細胞の発現量で良いかどうかの判断がつきません。。。 辛うじてバンドが出るようなら、検出系を改善するというても取れるのではと思いますが、、、 参考になるかどうか、、、 http://www.abcam.co.jp/HEK293-Human-embryonic-kidney-cell-line-GST-transfected-ab20916.html ここのFIG5DではHEKにGST-融合タンパクを発現させてます。抗体は、、、Santa Cruz Biotechnology Inc.ですね、、、 http://www.jci.org/articles/view/40583 その他HEKなどにGST融合タンパクを発現させているのはありますが、GST抗体で検出せずにHA-GST-xxxとか、特異的抗体を使ったりとかして、もしかしたらさけてるのかなぁ。。。

GSTタグ抗体　どれが使えるか？ 削除/引用 No.1049-1 - 2012/10/23 (火) 13:49:00 - Ｋ子 GST融合タンパク質の高感度の検出を希望します。 良い抗体はないでしょうか。 培養細胞にGST融合タンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトし、 そこから回収した総タンパク質を用いてウェスタンを行っているのですが、 今まで試したGSTタグ抗体はどれも結合活性が低く、ぼけたバンドしか出ません。 プルダウンして濃縮すれば比較的綺麗に検出できますが、 それでは目的が完全に達せられません。 良い抗体をご存じでしたら教えて頂けないでしょうか。 因みに、過去に使用して使い物にならなかった抗体は Wako, 013-21851, マウスモノクロ ナカライ, 04435-84, マウスモノクロ そこそこ使えるが感度が不十分な抗体（先述）は MBL, PM013, ウサギポリクロ MBL, PM013以上の感度の抗体を期待します。 情報、宜しくお願い致します。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---