BioTechnicalフォーラム [ウェスタンブロットでウェルの底が染まる]

ウェスタンブロットでウェルの底が染まる

No.10484-TOPIC - 2022/05/22 (日) 21:02:55 - あふ

ウェスタンブロットで175kDaのタンパク質を検出しようとしていますが、うまくいきません。ウェルの底に相当する場所にバンドが検出されてしまいます。これは非特異的なバンドなのでしょうか？　それともタンパク質が正常に流れていない（詰まっている？）のでしょうか？

プロトコルを示します；

1) RIPAで接着細胞を溶解→セルライセートを調製
2) BioRadの4x Laemmli Sample Buffer + βMEで95℃10分
3) 150V 1hでSDS-PAGE (7.5-15%)
4) PVDFに転写→ポンソーS Redで確認
5) 5% milk 1h blocking → 1次抗体でo/n
6) 2次抗体で1h → EZ ECL

同じPVDFでベータアクチンは正常に検出、150kDa付近の別のタンパク質も検出できています。
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全14件 ( 1 ～ 14 )　前 | 次　1/ 1. /1

(無題)

削除/引用

No.10484-14 - 2022/06/01 (水) 22:17:44 - あふ

パスワードを忘れたので解決にできませんが、この問題は解決しました。

>>膜タンパクが主なターゲットみたいなのでTritonX100で膜を可溶化すればいいかなとも思いますね

これが決め手となりました。お知恵をお貸しいただいた皆様、本当にありがとうございました。

(無題)

削除/引用

No.10484-13 - 2022/05/25 (水) 04:10:02 - おお

>[Re:10] あふさんは書きました :

> 10µgをロードしています。細胞のseeding densityの関係で、むしろこれ以上濃いライセートが手に入らないことが悩みでもあります（バンドが非常に弱いため）。

10ugぐらいなら標準的だと思います。察するに濃度も標準的と思えます。PBSをつかってスクレーパーでこすり取って遠心で細胞を回収してからLysisという手順は無理ですか？まあ１ Lane 多くて３０ug程が上限（コームの幅にもよるけど）だからロードの量で感度が劇的に改善するかどうかってところだと思いますが。
簡単に可溶化できるようなたんぱくだとRIPAよりもTritonX100だけのLysis bufferで抽出すると抽出された総蛋白量に対するターゲットのタンパク量が上がるので結果的に感度が高くなります。膜タンパクが主なターゲットみたいなのでTritonX100で膜を可溶化すればいいかなとも思いますね。

もっと極端なやり方だとHypotonicなデタージェント抜きのLysis bufferで細胞を破砕して、数百gで核などを除き、その後１０万gで膜だけを回収するという手もあることはある。

(無題)

削除/引用

No.10484-12 - 2022/05/25 (水) 03:55:20 - おお

いまはいろんなバリエーションがあるので一概にどうと言えないかもしれませんが、昔からある手法ではゲルの上から三ぶんの１あたりまではたんぱくの大きさに対してゲルがつまりすぎててTransferの効率が悪くなると言われてました（Gradientでなく均一なゲルで）。Gradientゲルでは解決する可能性が高いと思います。また私は昔の手法でWetのTankでオーバーナイトTransferをしています（２０Vぐらいで十数時間）。そうするとゲルの上部のTransfer効率がかなり改善されます。

確認作業としてTransfer後のゲルをCBBなどで染めたらどうでしょうか。また極端なばあいTransfer後のゲルに高分子のマーカーがうっすら見えることがあります。

(無題)

削除/引用

No.10484-11 - 2022/05/25 (水) 00:42:46 - あふ

連投申し訳ございません。質問を入力するつもりが流れてしまいました。

ゲルの端にVisible markerを流しているのですが、250kDaと150kDaのバンドの発色（青）がその下のバンド（75や40kDa）に比べて薄い事に気が付きました。これは、分子量の大きいタンパク質のTransfer効率が低いことを示していますか？　すなわち、175kDaの標的タンパク質のバンドが非常に弱いことと関連があるでしょうか？

現在のTransfer条件はCC 400mAで45min、ゲルの大きさは8x9cmくらいです。

(無題)

削除/引用

No.10484-10 - 2022/05/25 (水) 00:32:21 - あふ

皆様ありがとうございます。RT o/nでSDS化した結果ですが、目的の位置にバンドは出たのですが、それ以外の部分にもバンドが出てしまい、ブロッキング条件を検討することになりました。

>>ゲル濃度の変更
ありがとうございます。
次の注文のタイミングで買うか、自作を検討しています。

>>SDSの相対的な量が少なくなり、ボイルでタンパク変性がおこりアグル場合
>>何マイクログラムの総タンパクを、1ウェルにロード
ありがとうございます。
10µgをロードしています。細胞のseeding densityの関係で、むしろこれ以上濃いライセートが手に入らないことが悩みでもあります（バンドが非常に弱いため）。

>>抗体が、ポリクロなら、減らしてみる
抗体はモノクロです。Aggregationして検出できているバンドも非常に弱く、P-Abの濃度を下げるのにどうしても抵抗があります。

>>バンドが弱ければ、ECL基質を高感度なものに変えてみる。
これは発注をかけました。

>>1)の段階で、遠心して上澄を2)に使っていますね
12,000xg 15minで遠心し、上清を使用しています。

(無題)

削除/引用

No.10484-9 - 2022/05/24 (火) 05:29:13 - あの

ターゲットは、分子量がかなりデカいのですね。

ちなみに何マイクログラムの総タンパクを、1ウェルにロードしていますか？

アグりもあるでしょうけど、量が多すぎるということも無いですか？
抗体が、ポリクロなら、減らしてみるのも良いかも。

それでバンドが弱ければ、ECL基質を高感度なものに変えてみる。

それから、1)の段階で、遠心して上澄を2)に使っていますね？
もし遠心していないなら試してみると良いかも。

(無題)

削除/引用

No.10484-8 - 2022/05/24 (火) 02:34:14 - おお

Sample buffer中のボイルでアグリゲーションがおこる（あぐる）のはごく一部のたんぱくです。そういうたんぱくはアグった場合非常に大きなサイズとして検出されます。Wellのそこに引っかかるほどの大きいものは聞いたことがないですが、まず考えられる要因としてはやはりアグっているのかと思われます。

また、非常にたんぱく質濃度が高いときSDSの相対的な量が少なくなり、ボイルでタンパク変性がおこりアグル場合もあります（この場合はしばし沈殿が見られると思います）。この場合はWellのそこに引っかかっていてもおかしくはないですね。

(無題)

削除/引用

No.10484-7 - 2022/05/23 (月) 22:22:55 - が

ゲルの濃度を4-15%に変更したほうがいい。

(無題)

削除/引用

No.10484-6 - 2022/05/23 (月) 21:20:34 - あふ

皆様ありがとうございます

Aggregationという単語がどうしても出てこなくて、過去スレの検索ができませんでした。「ウェスタン詰まる」「タンパクまとまる流れない」とか検索しても出てこなくて困っていました。本当に助かりました。

標的にしているのは膜タンパク質なので、ご指摘のとおりと思います。

ひとつお伺いしたいのですが、標的タンパク質がAggregationを起こしてウェルの底に詰まってしまったとしても、アクチンβなどの小さいタンパク質はちゃんと流れるのでしょうか…？

(無題)

削除/引用

No.10484-5 - 2022/05/23 (月) 09:30:19 - G25

膜タンパク質など疎水性ドメインのあるタンパク質は、ボイルするとおそらく疎水結合によるアグリゲーションを起こします。室温とか37℃くらいの温和な加温で時間をかけてSDS化するのが良いとされています。

過去にたびたびトピに取り上げられていて、そのなかで様々な流儀が紹介されているので探してみては。

(無題)

削除/引用

No.10484-4 - 2022/05/23 (月) 00:33:11 - TS

アグるタンパクはいくつか試すといい。
finalで3xのサンプルバッファーで70℃10分とかでうまくいったのもあります。
Ureaを組み合わせるのもいいかもです。

(無題)

削除/引用

No.10484-3 - 2022/05/22 (日) 23:11:56 - あふ

いまからo/nさせてみます。ありがとうございます。