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(無題) 削除/引用 No.10483-21 - 2022/05/24 (火) 16:34:53 - おお >[Re:20] 666さんは書きました : > みなさんありがとうございます。 > > 正直、時間をかけたくないので（他の実験に時間を割きたいので）、今あるプラスミドでさっさと済ましてしまいたいというのが、根底にはあります。無駄なものを入れたくないという気持ちもあります。 > > 薬剤耐性遺伝子を入れないのは、レビュアーからケチがつきますかね。 > > > stableが作成されていれば、目的の遺伝子が抜けたなんて過去に、全然経験はありませんが。 べつにStableに発現している事が示せたならば、耐性遺伝子が入ってなくても樹立できたんだから文句の言いようがないです。Integrationはほぼランダムで、Transcriptionがアクティブなところに入りやすいと言われているので、Integrationした場所がたまたまあなたの調べたい遺伝子ということはもしかしたらあるかもしれないでしょうけど、染色体が１本のハプロイド出ない限り完全にKOされるわけでもありませんし、いままで発現が見られなくなったという事は聞いたことがありません。また、このような実験では大抵複数のクローンを拾って、ちゃんと考えている実験系に使えるものだけを選ぶようにするわけですから、やりようがあるということです。あるいはシングルのクローンを拾わず、Cell sortingでエンリッチメントを繰り返すだけにすれば得られる細胞集団はヘテロでたまたま都合の悪いクローンが混じっていても、ほとんど影響がない可能性が高いです（効率が極端に低くなければ）。 手間を省きたいと言いますが、TransfectionしてSortingを繰り返したりとかして、Stableが取れるか未知の部分があるとなると、個人的には随分手がかかるような気もしますが、まあ自身のスケジュール感とか色々あるでしょうから、それでも手間が省けているという判断ならべつにそれでもいいです。

(無題) 削除/引用 No.10483-20 - 2022/05/24 (火) 15:53:38 - 666 みなさんありがとうございます。 正直、時間をかけたくないので（他の実験に時間を割きたいので）、今あるプラスミドでさっさと済ましてしまいたいというのが、根底にはあります。無駄なものを入れたくないという気持ちもあります。 薬剤耐性遺伝子を入れないのは、レビュアーからケチがつきますかね。 stableが作成されていれば、目的の遺伝子が抜けたなんて過去に、全然経験はありませんが。

(無題) 削除/引用 No.10483-19 - 2022/05/24 (火) 14:29:09 - おお >[Re:17] 666さんは書きました : > 3週間ほど時間をあけてscreeningをすれば、transientなものは概ね除外出来ると考えているのですが、考え方が甘いでしょうか。 可能性としてはYesでしょう。Integrationの効率は良くて約１万分の一（薬剤による選択圧がかかっている状態で）。実際にできるかは運もあるかもしれません。でもそうして得られたという文献があるならやってやれないことはないという事かもしれません。ゲノムのダメージを少し与えるとIntegrationの効率は上がりますが、それがいいことかどうかは判断できません。私ならEnrichをもう少し頻繁にしてIntegrationが起こった細胞をなるべく濃縮して最終的なスクリーニングでポジの確率を上げるようにするかもしれません。 １週間に１回で３週間として、３週目にはシングルコロニーを拾える状況にするとか。 最初は薬剤耐性の入ってないプラスミドを買ってしまったということで、薬剤耐性でスクリーニングする予定のような質問だったので随分回答が大回りになってしまっている。最初のスレ立てたときの質問はどういうつもりだったんでしょう。もう少し具体的にこういう系があったとか、こういうデザインを考えているとか書いてくれればやりやすかったのに。 あとCasについては勘違いされているようなので、Cas9 homologous recombinationなどのワードで確認してください。人為的にCas9で特定の場所にノックインする方法です。AAさんの系もこれだと思います。

(無題) 削除/引用 No.10483-18 - 2022/05/24 (火) 13:13:15 - AA 間をあければ、というのは正しいと思います。 厳密には期間というよりも継代数など増殖回数を反映したもののほうが良いと思います。基本的には一過性導入になったプラスミドは細胞分裂を経て希釈されていきますが、分裂回数が少ないと時間を空けても残っているんじゃないかと思います。 なお、リポフェクションで安定発現株が作成できるのは基本的にはゲノム上へ外来DNAが取り込まれるからで、単に発現させたいDNAだけ入れる場合はランダム挿入、Casなどを使う場合はターゲティング、という点が異なるだけです。 どちらのほうが目的にそっているかはご自身でご判断いただければと思います。 >>当たりを得るには９６Well plateで5-10枚ほしいところ そのとおりだと思います。初回だったのと、懐事情の問題でプレート枚数をケチりたくて1枚だけでやったら取れたのは幸運でした。

(無題) 削除/引用 No.10483-17 - 2022/05/24 (火) 12:55:00 - 666 3週間ほど時間をあけてscreeningをすれば、transientなものは概ね除外出来ると考えているのですが、考え方が甘いでしょうか。 今文献を探せなくなってしまったのですが、2nd screeningを時間を挟んで入れることで成功していた例を見ますし、CAR-T細胞療法などでは、アレルギーを防ぐために、薬剤耐性遺伝子をいれないように工夫されているようです。 私が目指しているのは、cas9 basedではなく、Effectene等を用いての導入ですが。

(無題) 削除/引用 No.10483-16 - 2022/05/24 (火) 12:42:53 - おお AAさま、詳細ありがとうございました。カセットノックインはだいたい1%ということはその効率と想定して当たりを得るには９６Well plateで５〜１０枚ほしいところですね。

(無題) 削除/引用 No.10483-15 - 2022/05/24 (火) 11:49:49 - AA 最終的には89クローン中3クローンが目的通りでした。 FACSでEGFPポジ(ネガコンとして未操作の元細胞を流した結果と比べてゲーティング)を、直接96wellプレートに1細胞ずつ回収し培養、その後継代可能なくらい増えてもまだ蛍光の見えたものをPCRでタイピングしました。なのでGFPネガのクローンについては解析していません。(7ウェルはソーティング後増えませんでした) なんかpuroの効きがいまいちでリング内にシングルで取れなかったのでFACSしましたが、リングでシングルクローンにできるならFACSいらないと思います。 カセットノックインはだいたい1%くらいの効率と聞いていたので結構取れたなという印象でした。 プラスミド由来の一過性発現で濃縮するのは常套手段のようで、むしろこれをしないとクローン数が大変なことになって実験がままならないのではないかと思います。 ランダムインテグレーションで入っていても取れてくる手順なのでCasが残っていないかどうかは一応確認しました。CasベクターはsgRNAも入っているので残っているとオフターゲットなんかが問題になるんじゃないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10483-14 - 2022/05/24 (火) 10:46:06 - おお >[Re:13] AAさんは書きました : > 以前、CasでAAVS1座へのEGFPノックイン株(ヒト由来細胞)を作ったときは、Casのベクター由来の一過性のpuroで1stセレクション、クローニングリングで分けたものをEGFPのFACSで2ndセレクションをして、96wellに1枚とったらEGFPポジのクローンが複数得られました。 ちなみにもう少し具体的に何個ぐらいですか？興味があります。 > > (理由や合理性はいったん脇において)導入される配列を厳密にしたいならノックインのほうが良いかもしれません。 > マルチコピーで入らなくなるので発現の強さは負けるかもしれませんが。 > ＞例えば、2種類のプラスミドを混ぜてトランスフェクションをして、数日後に、1st screeningを行って、second screeningは色でセレクションを行い、さらにPCRで2nd plasmid もしかしたらこれってこれってAAさんが示している方法を言っているのでしょうか。。。原理がわからないで取れる思っているなら実際やっても結果がでなくて混乱するだけになってしまわないかと、、、 Casの系でIn delを作ってKOするような場合はCasの発現ベクターに蛍光か薬剤耐性遺伝子で高発現している細胞をEnrichすると結構な割合でうまく行った細胞が取れるみたいですけどね。でこの場合も蛍光か薬剤でSelectionしますが、Stable取っているわけではなくってTransientに発現している細胞をEnrichしているだけ。それでその中に実際にCasがうまく働いた細胞を見つけるわけで、得られた細胞にはCasの遺伝子はもう存在しない（一応それを確認するかもしれないけど）

(無題) 削除/引用 No.10483-13 - 2022/05/24 (火) 10:22:34 - AA 以前、CasでAAVS1座へのEGFPノックイン株(ヒト由来細胞)を作ったときは、Casのベクター由来の一過性のpuroで1stセレクション、クローニングリングで分けたものをEGFPのFACSで2ndセレクションをして、96wellに1枚とったらEGFPポジのクローンが複数得られました。 (理由や合理性はいったん脇において)導入される配列を厳密にしたいならノックインのほうが良いかもしれません。 マルチコピーで入らなくなるので発現の強さは負けるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.10483-12 - 2022/05/24 (火) 10:14:45 - おお いろの選択だけでStableを取るのは無謀です。 例えば非常にTransfection効率のいい細胞を１０cmDishにまき薬剤耐性のマーカーの入ったプラスミドを導入して薬剤耐性のStableのクローンが現れるのは数百個あれば多いほうです。１０cmDishですから数百万の細胞があるなかで良くて１万分の１です。ではその細胞に同じ要領で蛍光たんぱく質発現プラスミドを導入したとしましょう。７０％ぐらいが光ってたとして、その中の１万分の１の細胞が実際にインテグレートされる事になります。それをどうやって探すのでしょうか？ ＞googleで検索をかけると、色だけでセレクションしている人もいるようです。 それはどんな方法か確認してみないとなんとも言えませんが、Transientの発現で発現している細胞をEnrichするためにはよくSortingは使われます。 ＞例えば、2種類のプラスミドを混ぜてトランスフェクションをして、数日後に、1st screeningを行って、second screeningは色でセレクションを行い、さらにPCRで2nd plasmidが入っているクローンは除外するなど方法は考えられそうですが。 いっていることはよくわかりませんが、発現＝Stableではありませんよ。 もしかしたらHomologous Recombinationを使うといくらか効率が上がって拾えるのかもしれませんけど、普通はHomologous Recombinationでも薬剤耐性マーカーを使いますからねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.10483-11 - 2022/05/24 (火) 09:18:19 - 666 単純に、mCherryの色だけでセレクションをかけるのは駄目ですか？ googleで検索をかけると、色だけでセレクションしている人もいるようです。 薬剤耐性遺伝子は極力入れたくない状況です。 例えば、2種類のプラスミドを混ぜてトランスフェクションをして、数日後に、1st screeningを行って、second screeningは色でセレクションを行い、さらにPCRで2nd plasmidが入っているクローンは除外するなど方法は考えられそうですが。

(無題) 削除/引用 No.10483-10 - 2022/05/24 (火) 02:11:48 - おお >[Re:1] 666さんは書きました : > pCAGGS mcherryを購入して、マウスの培養細胞のstableを作成したいと考えています。 > ウイルスではなく、トランスフェクションで行う予定です。 > プラスミドには、アンピシリン以外に薬剤耐性がないことを、あとから気づいたのですが、このまま進めるのは無謀でしょうか？ >[Re:7] 666さんは書きました : > Puromycin抵抗性遺伝子はゲノムにintegrateさせたくないと考えています。 > > しかもレンチで導入するわけではないですが、2種類入れるのはどういった原理ですか？ もう少し詳しく書いたほうが良さそうなので繰り返します。抗生物質のセレクションなしでステイブルを樹立するのは無謀です。セレクションマーカが発現したい遺伝子の発現ベクターにない場合は、そのベクターに１０分の１程度の量のセレクションマーカーplasmidを混ぜてTransfectionして薬剤耐性を獲得したクローンを拾います。よく使われる手法です。 原理は何かというとそんな難しいメカニズムがあるわけではなく、Transfectionで細胞内に入るプラスミドは１分子というわけではないこと。薬剤耐性のセレクションでIntegrationされるプラスミドは１コピーということは殆どないこと（多分１０コピーとか数十コピーとか）。そういうことから薬剤耐性を獲得した細胞には目的のプラスミドが入っている可能性が高いということです（割合を十分の１とかにするのはそういう可能性を高くするため、よく入る細胞なら２０分の１ぐらいでもいいでしょう）。 Puromycin抵抗性遺伝子はゲノムにintegrateさせたくないとおっしゃいますが、目的の遺伝子が発現するプラスミドは複数箇所Integrateしているのにどういう理由でしょうか？もしそのプラスミドにPuromycin抵抗性遺伝子も乘っていたら、Puromycin抵抗性遺伝子とあなたの発現したい遺伝子が同じ箇所にIntegrateされることになりますが、それは大丈夫なのでしょうか？mcherryを発現する時点でマウスへの移植時の抗原性などを気にしているとは思えないですし、、、

(無題) 削除/引用 No.10483-9 - 2022/05/23 (月) 18:53:55 - qq 別のプラスミドに乗せ換える方が楽なんじゃなかろうか？

(無題) 削除/引用 No.10483-8 - 2022/05/23 (月) 15:05:05 - おお The trans method of co-transfection is a good alternative in instances where the target construct does not have the antibiotic-resistance gene in the vector backbone. In such cases, a plasmid mixture containing 5 to 10 parts gene expression plasmid and 1 part antibiotic selection marker plasmid can be introduced into cells. This plasmid ratio helps ensure that the selected cells will express both the gene of interest and the selection marker. https://www.mirusbio.com/tech-resources/tips/generate-stable-cell-lines

(無題) 削除/引用 No.10483-7 - 2022/05/23 (月) 14:35:06 - 666 Puromycin抵抗性遺伝子はゲノムにintegrateさせたくないと考えています。 しかもレンチで導入するわけではないですが、2種類入れるのはどういった原理ですか？

(無題) 削除/引用 No.10483-6 - 2022/05/23 (月) 13:13:21 - _- ではおおさんがいうように目的プラスミド10ugとpuro耐性遺伝子を持つplasmidを１ugをトランスフェクションしてpuro selection。 mCherry+のコロニーをピックアップしてくださいませ。

(無題) 削除/引用 No.10483-5 - 2022/05/23 (月) 04:52:33 - おお >[Re:2] _ -さんは書きました : > FACSでsortingとか But, you would not get stable cell lines by only sorting, would you?

(無題) 削除/引用 No.10483-4 - 2022/05/23 (月) 03:51:59 - 666 ありがとうございます。 pCAGGS-mCherryを強制発現させたマウスcell lineを作成して、それをマウスに導入して、in vivoで、増殖させたのちに、諸々の実験に使う予定です。 論文を見ていると、セレクションなしで、sortingでstableを作成している例もあるのですが、そもそも、selectionを使えるのは、plasmid作成時のみで、in vivoになると、抗生剤耐性遺伝子は何の意味もなくなります。 そういう意味では、sortingして、その後限界希釈して、single cellするだけでもstable作成には、問題ないのでしょうか。あるいはレビューアーからケチがついたりしますでしょうか。 他のプラスミドから、薬剤耐性遺伝子を移し替えてもいいと思っているのですが、プラスミド上で、何も機能がない場所であれば、どこに入れてもいいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10483-3 - 2022/05/22 (日) 21:10:24 - おお You could transfect it mixing a marker plasmid with a ratio of ten to one or less.

(無題) 削除/引用 No.10483-2 - 2022/05/22 (日) 20:56:24 - _ - FACSでsortingとか

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