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(無題) 削除/引用 No.10474-8 - 2022/05/21 (土) 10:06:39 - あの 培養実験では、FBSを1%だけにして、 BSAを0.1%添加するとかの方法もあります。 ちなみに、 コラーゲンの場合だと、コラーゲンがシャペロン役のHSP 47の調節するとか、 ユビキチン類似タンパクがHSP 47を壊すとか、 細胞のキャラ次第で振る舞いが変わるとか 色々あるらしくて、 相当に奥が深いらしいです。

(無題) 削除/引用 No.10474-7 - 2022/05/21 (土) 01:37:18 - おお ん、MMPとかで効率的に分解されてはないですよね。

(無題) 削除/引用 No.10474-6 - 2022/05/21 (土) 01:35:10 - おお >[Re:4] ちーたんさんは書きました : > まだ、経験値が足りないので、質問させてください。 > > 1.おっしゃる通り、フィードバックがかかって、時間がかかると低減する遺伝子も存在するのは多数の論文で確認していました。ただ、現状で12hでほぼ候補遺伝子がないので、どちらかというと、長期かなと思っていました。 > 世の中便利になったので、発現プロファイルをみればいいとなるのはわからなくはないのですが、（もちろんそれも研究スタイル何でしょうけど）、そのECMをかけて細胞がどんなリアクションするのかなど少し具体的なデーターをいろいろと蓄積していくほうがやりやすいのではと思う次第です。 増殖に変化があるのか（変化があるならどんな条件で）、形態が変わるのか、マーカーなどの変化はあるのか、リスポンスの高い細胞がないかなど。またそのリレプターやECMはどの細胞で発現してて、なにか生理的、病理的な関与は報告されているのか、KOマウスなどのモデルはあるか。マウスだけでなく他のモデル動物ではどうか（ハエ、エレガンス、酵母、魚、カエルなど）。 直接的ではないにしろ、公開されているRNseqやマイクロアレーのプロファイルで高い集団、低い集団などに分けるとなにか見えてこないかなども見ていてもいいだろうと思えます。 > 気になっているのは短時間であれば、FBSを抜いて飢餓状態にできますが、長時間培養になるとFBSを入れるので条件が甘くなるのかなとも考えています。 > FBSを抜いているのは早期の変化を見るための手法と思われますが、なぜ３０分後とか１時間後とか見ないのか不思議ではあります。１２時間後って細胞ヘタってないですか？加える前と後で比べているのですか、ECM＋とーで比べてるのですか？ > 2. dishにcoatingした方がいいのか、培養液に入れた方がいいのかも悩んでいます。coatingすると、coatingしていない分は除くので、 浮遊細胞何でしょうか？コーティングがあまり効率よく細胞に刺激を与えないと言うなら、コラーゲンゲルやマトリゲルに混ぜ込んで３Dのような環境にすればどんな細胞にも接触しているという状況は作れると思いますが。結合しているところが外部から固定されているのがなにかのシグナルにならないかなと漠然と思ってます。 そういえばFAKのリン酸化カスケード、Fアクチン形成など細胞骨格の変化などは見ないのですか？

(無題) 削除/引用 No.10474-5 - 2022/05/20 (金) 19:52:42 - あの もう少し、具体的な情報が無いと、お答えできないです。 せめてそのECMの名前ぐらい開示できませんか？コラーゲンの何型とか。 それから何のセルラインを、何のコーティングしたとこで培養してるかとかも。 IPAは使えないなら、パブメドをよく使うのが代替手段です。

(無題) 削除/引用 No.10474-4 - 2022/05/20 (金) 15:47:19 - ちーたん まだ、経験値が足りないので、質問させてください。 1.おっしゃる通り、フィードバックがかかって、時間がかかると低減する遺伝子も存在するのは多数の論文で確認していました。ただ、現状で12hでほぼ候補遺伝子がないので、どちらかというと、長期かなと思っていました。 気になっているのは短時間であれば、FBSを抜いて飢餓状態にできますが、長時間培養になるとFBSを入れるので条件が甘くなるのかなとも考えています。 2. dishにcoatingした方がいいのか、培養液に入れた方がいいのかも悩んでいます。coatingすると、coatingしていない分は除くので、全体としてのタンパク質濃度は薄くなりますよね。さらに浮遊したものは解析から除外して、くっついたやつだけを比較するのかでも結果が変わってきそうです。そうなると培養液に入れれば、難しいことは考えないでもいいのかなと考えています。 3. IPAというソフトは、qiagenと契約する必要があるのでしょうか？類似のドライの手法はありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10474-3 - 2022/05/20 (金) 04:17:55 - あの 待ち時間を長くするだけではなく、短くするのも検討が必要だと思います。 数時間とか。 それから、ウェットだけで試行錯誤するのではなく、 ドライも組み合わせた方が良いと思う。 その分子のキーワードをとっかかりに、どういう上流や下流の分子群があるか、 IPAなどのソフトで検索した上で、先行研究での設定時間を調べて参考にする。

(無題) 削除/引用 No.10474-2 - 2022/05/20 (金) 02:25:22 - おお 分化のプロセスとかは１週間とかそれ以上の非常に長い時間かかる実験系もあります。そういう過程の中ではほとんど変化してない状態がしばらく続いているようにも見えます（実際RNseqやったわけでもありませんが）。やってみたらということなので反抗するほどのことがあるのかと思ったりもします。 そのmatrix分子は培地に添加しているのですか？Dishなどの底にコートしたらどうですか？コートするにあたってコラーゲンなどに混ぜるというのもあり得る選択かもしれないし。色々とできそうなことがありそうなので思いつくことをコツコツやっていけばどうでしょうか。

シグナルパスウェイの解析 削除/引用 No.10474-1 - 2022/05/19 (木) 13:56:52 - ちーたん Extracellular matrixの研究をしています。 ある特定のmatrix分子に着目していて、免疫沈降により、細胞側の結合相手のタンパク質を同定しました。 このmatrixが結合した場合のsinaling cascadeを同定したいと考えているのですが、12h置いた段階では、RNA sequencingで変動する遺伝子で目立つものはほとんどありませんでした。 上司からは、3daysや6days置く実験系もあるから、濃度を上げたうえで、さらに長期の培養をしてもう一度比較してはどうかという提案を受けたのですが、12hでは差がなくても、3days以上で初めて差が出るようなこともあるのでしょうか。

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