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(無題) 削除/引用 No.1047-7 - 2012/10/23 (火) 09:26:29 - ~ 修復系が働く前だったり、回収中にdsDNAがアニーリングしていれば、ミスマッチのものが取れてもおかしくはないと思いますが。 ブロードというのはゲルイメージ中のバンドが長いということですよね？ ある特定の位置に複数の塩基が存在する場合、複数のシグナルが検出はされますが、そのシグナルの長さにはあまり変化がみられないと思います。 ヘテロな遺伝子のダイレクトシークエンシングの際には、シグナルの高さが揃いこそはしませんが、幅に影響は見られません。 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168827800803906 (Fig.4) 現象と仮説がマッチしていないように見えますが。

(無題) 削除/引用 No.1047-6 - 2012/10/22 (月) 22:57:59 - おお Gリッチもダメな場合がありなすね。ヘアピンではないですが構造的な問題です。

(無題) 削除/引用 No.1047-5 - 2012/10/22 (月) 18:50:07 - シークエンス ヘアピン構造を作るような場合、向きによっては サイクルシークエンスの反応が進み難く、 結果としてシークエンスが読めない事があります。 例えば、 ＩＲＥＳをフォワードから読もうとすると、 すぐにシグナルが落ちて読めなくなるけど、 リバースから読むと簡単に読めるとか、 ｓｈＲＮＡの配列を確認する時とかが、 挙げられるでしょう。 ベタインを入れて高次構造を少しでもほぐしてやるとかで、 読める場合もありますが、読めない事もあります。

(無題) 削除/引用 No.1047-4 - 2012/10/22 (月) 18:00:47 - おお PCRプロダクトであればPCR酵素の fidelity と言うものがあります。確認されると良いですが可也正確に読んでいます。ということはAに対してTを、Tに対してAを、Cに対してGを、、、というふうに正確に合成しているということです。 大腸菌から取れたプラスミドは大腸菌の中にあるDNAポリメラーぜによって合成されています。このポリメラーゼは好熱性ではありませんが、PCR酵素と基本的に同じ役割をしています。ごくまれにミスマッチの塩きをいれることはあるのですが、その場合PCRでは反対の鎖を読む時にそのミスマッチにたいして、対応した塩きをいれるので、ミスマッチが保存されることはありません。なのでミスマッチのペアーが保存されることはありません。 くわえて細胞の中では、ミスマッチがおこると、修復酵素が活性化してちゃんとしたペアーに戻す作業もやっています。 それでもミスマッチがあるというならそれはそれで面白いですがどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1047-3 - 2012/10/22 (月) 16:12:04 - AP >ふと上記のようなことがありえるならフォワード側も正確に読まないと信頼性が無いのではと思ってしまいました。 両側鎖を読んだほうがいいのは、dideoxy chain-termination 法（サンガー法）では、配列によって、バンド間隔の圧縮が起こったり、連続するバンドの濃淡が極端になったり、シグナルが非常に弱くなったりという、クセがあり片側だけ読んだのでは読み間違うことがあるからです。上記のような問題も逆の鎖を読むと解けることが多いのです。 しかし今では、基質のモディファイとかアルゴリズムによる補正とかで、出力される配列の間違いというのはかなり少なくなっているし、すでにゲノムの解読が終わっていて、正解の分かっている配列をベクターに乗せ変えたときの検算のような目的が多いので、片側だけでも問題になることは少なくなっていると思いますが。 >DNAはAに対してT、Gに対してCという相補性があるといいますが、何らかの原因でAに対してCが結合を作ったりGに対してTが結合したまま安定に存在することはありえるのでしょうか。 たくさんの細胞からなる生物試料のDNA分子の全てで、あるいはPCRで増やしたDNA分子全てで、再現性よく保持されるミスマッチがあるのではないかと？ あると思いますか？　あったら、生物の重要な基盤が根底から崩壊しますね。

(無題) 削除/引用 No.1047-2 - 2012/10/22 (月) 15:12:32 - おお テンプレートは何でしょうか。。。相補鎖のソースが人口的であるとか限られている場合はミスマッチはあると思いますが、、、

塩基の変異について 削除/引用 No.1047-1 - 2012/10/22 (月) 14:53:03 - M1 DNAはAに対してT、Gに対してCという相補性があるといいますが、何らかの原因でAに対してCが結合を作ったりGに対してTが結合したまま安定に存在することはありえるのでしょうか。 というのも、現在dsDNAの配列をサイクルシークエンシングで解読しているんですが、フォワードプライマーの方でどうしてもブロードとなって綺麗に読めない部分があるんです。対してリバースプライマーでは同じ部分が綺麗に読めたので、こちらで補って配列決定しようと思ったんですが、ふと上記のようなことがありえるならフォワード側も正確に読まないと信頼性が無いのではと思ってしまいました。 初歩的な疑問だと思うのですがご教授お願いします。

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