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ありがとうございます。 削除/引用 No.10458-6 - 2022/05/13 (金) 21:12:33 - オペロン みなさま、お返事ありがとうございます。 QIAGENの"Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells and Purification of Total RNA from PBMC Using the RNeasy Micro or Mini Kit"のプロトコールを参照しております。 3日間培養後のPBMCはフローサイトメトリーの7AADで確認しますと生存率は80%ほどでした。抗癌剤との共培養の生存率は70%ほどです。 1検体は1×10^6個を想定しております。 RNAに抽出するだけの細胞数はあると考えておりました。 もしかすると、抽出の過程で想定より少ない数になってしまっているのかもしれませんね。。 言葉足らずで申し訳ありません。 PBMC採取直後のRNA抽出は試みておりません。 確認する必要はあるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10458-5 - 2022/05/13 (金) 18:37:25 - SYBR master >[Re:1] オペロンさんは書きました : > 現在、自分の血液検体よりPBMCを採取し、QIAGEN RNeasy Mini Kitを用いてPBMCのRNAの抽出を試みています。 RNA抽出する細胞数を考慮してみてください。これは、日本語マニュアルにも書いてあるはずです。PBMCなので細胞が増えてることは少ないと思いますが、カラム系のkitは推奨の細胞数より多い細胞を使用すると、RNAが全く取れなくなります（同僚が経験済み）。RNA結合のキャパが問題なはずなのですが、キャパ超えたときは何故か全く取れなくなるみたいです。 細胞数が計測できない場合、先にphenol系のRNA抽出キット(RNAzol等）を使用してRNAを抽出して、カラム系で精製すると良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.10458-4 - 2022/05/13 (金) 17:09:05 - ｔんた PBMCは単球は接着細胞、それ以外のリンパ球などは浮遊細胞として培養すると思いますが、培養後の細胞生存率はどのくらいでしょうか

スケール 削除/引用 No.10458-3 - 2022/05/13 (金) 17:08:42 - ema RNeasy Mini Kit　とありますが、細胞が少なくRNAも少なければ洗浄中ロスでほぼ無い状態になることがあります。 予想細胞数はどれくらいでしょうか。 マイクロキットを使った方が良いのかもしれません。 抗がん剤共培養（この培養スケールも気になります）という事はもしかして細胞ダメージが大きすぎて、ほぼ生きていない状態になっていても、抽出できない、品質が非常に悪いと思います。

(無題) 削除/引用 No.10458-2 - 2022/05/13 (金) 17:01:31 - G25 >なお、PBMC抽出やRNA抽出の手技自体は他実験で成功しております。 ということはPBMC単離直後ならRNA抽出は問題なくできているということ？ 検体採取後速やかに処理すべしというのはなんでも一緒だけど、抽出後3日後とは言え単に保存されてたのではなく、培養されて「生きている」のだから細胞内のRNAが全く分解しているということはないはずである。

PBMC培養後のRNA抽出 削除/引用 No.10458-1 - 2022/05/13 (金) 16:49:22 - オペロン wet実験の初学者です。 現在、自分の血液検体よりPBMCを採取し、QIAGEN RNeasy Mini Kitを用いてPBMCのRNAの抽出を試みています。 PBMC抽出後に3日間抗癌剤などと共培養(37℃)し、その後にRNA抽出を行いましたが、共培養をしていないPBMCも含めて、RNAは回収できませんでした。PBMCのような血液検体は速やかに処理することが大切だとは思うのですが、やはり3日間も培養してしまうとRNAは分解されてしまうのでしょうか。何か良い方法がありましたら、ご教授いただけますと幸いです。 なお、PBMC抽出やRNA抽出の手技自体は他実験で成功しております。

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