全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.10453-9 - 2022/05/15 (日) 08:05:04 - TK-1 キットなんか安いんだから、トラブルシューティングに時間を浪費するよりよほどいいと思う。時間は買うもんですよ。

(無題) 削除/引用 No.10453-8 - 2022/05/14 (土) 09:11:14 - おお あ、そっか

(無題) 削除/引用 No.10453-7 - 2022/05/14 (土) 08:00:03 - G25 しかし、 > インサートの違いでも変わりありません。 と言っているからなあ。

(無題) 削除/引用 No.10453-6 - 2022/05/13 (金) 23:30:46 - おお たまにGストレッチとかG絡みの配列で反応が進まずシグナルがそこでストンと落ちることもありますね。複数クローンを読んでると思いますが特定の配列でシグナルが落ちてませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10453-5 - 2022/05/13 (金) 18:46:12 - SYBR master >[Re:1] さんがさんさんは書きました : > 最近ラボを変わり、外注施設も替えましたが、産物のシークエンスが200 bp程度までしか読めません。以前のラボでは問題なく7-800まで読めることが多かったと思います。 読める長さが短い場合は、下記が原因であることが多いです。 1. 鋳型DNA量の見積もりミス、または過剰なprimer 2. DNAテンプレート中の二次構造（ex. hairpin loops, palindromes） 3. GCまたはGTリッチな領域 4. サンプルがsiRNAコンストラクトの場合 5. poly N配列がある 今回は >以前の所属先の技官さんには、「あなたのサンプルにベタインを入れたら読めるようになった」と言われたことを思い出しました。 とあるので、たぶん２または３が原因だと思われます。 DMSOまたはベタインの添加で変わるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10453-4 - 2022/05/13 (金) 17:14:22 - G25 >RNAseも間違いなく入れています。 >PEG沈を行ってからサブミットするように、とは言われてはいませんが、するべきでしょうか？ どちらもRNAあるいは消化されたRNA断片を除去するのが主目的です。 RNAのコンタミはKlenowなどを使ったクラシックなサンガー法ではクリティカルでした。RNA断片があると非特異的なプライマーとして働き、すべての塩基位置ですべての塩基種のバンドがでるという問題を引き起こします。 しかし、この現象は耐熱性ポリメラーゼを使ったサイクルシークエンスでは起きません。なので、自動プラスミド抽出機で取ったRNA除去を全くしていないようなプラスミドでも、そのまま使ってほとんど問題ありません（シークエンス試薬・機器供給メーカーは、そうは言わないですが）。 少なくともあなたが出くわしている症状とは無関係です。

(無題) 削除/引用 No.10453-3 - 2022/05/11 (水) 00:52:34 - おお わたしもテンプレートが多いのかなと思う。Sequencingの反応液（酵素）は希釈して従来の数分の１ほどで反応させることができるため、希釈倍率はそれぞれのやり方があるのかもしれない。たまたま高い希釈倍率でやっていてれば昔の場所ではうまく行っていた量でも、今のところではテンプレート過剰になることもあるかもしれない。 依頼先とそれを含めて、そこでのベストなサンプル調製（量をふくめた）について話し合ってみてもいいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.10453-2 - 2022/05/10 (火) 22:59:34 - G25 投入量の見積もりは如何に？ 症状としてはテンプレート量が多すぎの時に見られるやつ

miniprep産物のシークエンスが読めません。 削除/引用 No.10453-1 - 2022/05/10 (火) 22:51:20 - さんがさん 大変稚拙な質問で恐縮ですが、アドバイスいただけましたら幸いです。 キアゲンの公開レシピに倣い、自作のP1 (+RNAse), P2, P3バッファーで2 mlのStbl3の菌体をminiprepし、最後にエタちんしてからそのペレットを10 mM TE 1 mM EDTA (Hereafter TE buffer)に溶解したものを外注しています。turn around timeは１日です。最近ラボを変わり、外注施設も替えましたが、産物のシークエンスが200 bp程度までしか読めません。以前のラボでは問題なく7-800まで読めることが多かったと思います。 今の場所に異動したところ、中には5-600まで読めるものもありますが、ほとんどが200くらいで突然ピークの高さが低くなり、検出できなくなります。 ベクターバックボーンの異なるものでも変わりなく、インサートの違いでも変わりありません。 外注先に問題があるとは思えないので、自分のサンプルがおかしいのだと思います。 以前の所属先の技官さんには、「あなたのサンプルにベタインを入れたら読めるようになった」と言われたことを思い出しました。 自作のバッファーのレシピは何度もダブルチェックしていますし、pHも正しいはずです。RNAseも間違いなく入れています。 考えられる原因として何がありますでしょうか？ PEG沈を行ってからサブミットするように、とは言われてはいませんが、するべきでしょうか？ ご意見いただけましたら本当に嬉しいです。。。どうか、よろしくお願いいたします。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---