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(無題) 削除/引用 No.10449-5 - 2022/05/13 (金) 02:09:22 - おお そういえば昔PolyAをLTRに挟まれた内部につけているレトロかレンチのConstructを見たことがあるような気がしてしらべてみました。確かにあるにはあります。PolyAをつけるほうが発現が強いけどパッケージング効率は下がるということを示した論文もありました（もう閉じちゃってどれか示せませんけど）。 ConstructにもよるのだけどPolyAを入れる選択肢はない訳ではなさそうですが、IRESの前にPolyAはないなと思います（それで発現させるのは無理ゲーです）。間にプロモーターがあれば別ですけど。ただ、質問を読み返すとパッケージングのときは光ってるんですよね。じつはPolyAはなくって、プロモーターとInfectionした細胞の相性が悪いとか、、、どれぐらいの細胞に感染したとかわかりますか？

(無題) 削除/引用 No.10449-4 - 2022/05/12 (木) 16:59:39 - mp そもそもRfA入りのベクターでウイルスを作る目的がわかりません。RfAはcDNA挿入の目的に使われるものなので。空ベクターのコントロールであればpLenti-EF1alpha-MCS-IRES-GFPで十分です。

(無題) 削除/引用 No.10449-3 - 2022/05/12 (木) 14:39:13 - Karas おおさんの指摘の通りです。 大腸菌で機能させたいRfaにpoly Aシグナルを入れるのは考え辛いですが、仮にpoly A シグナルが入っているのであれば、作製されたレンチウイルスの感染能は低くなっており、うまく発現しないというのはあり得ます。 しかしpoly Aが実は入っていないという可能性も考えると、別な理由でレンチウイルスが出来ていないのかもしれません。 そしてパッケージ細胞にプラスミドを導入して光っていても、ウイルス粒子がきちんと産生されていない、というのはあり得ることです。 取り敢えず原因究明への近道は、今一度RFA周りの配列情報の確認を行うことだろうと思います。

(無題) 削除/引用 No.10449-2 - 2022/05/10 (火) 01:07:37 - おお >原理的にRfaのpolyAがあるので 原理的って、、、なんですか。あるはずだけど確認してないってことですか？それならそうかも知れないなと言えるかもしれませんが、答えは出ませんよ。 PolyA signalがあればお考えのようにそこで転写が集結します。 ウイルスパッケージングのときに導入した細胞（２９３T細胞系列のもの使ってると思うけど）は、光ってましたか？ん、っていうか、PolyA signalが途中にあると完全なウイルスベクターができるか？

Rfaがあるとレンチウイルスが作れません 削除/引用 No.10449-1 - 2022/05/09 (月) 22:26:30 - rho pLenti-EF1alpha-Rfa-IRES-GFPというPlasmidを使ってウイルス作製を試みています。 Rfaの中にccdbという致死遺伝子がありますが、これは哺乳細胞では無害のはずでtransfectされても細胞は原理的に死なないはずです。 ところが、pLenti-EF1alpha-MCS-IRES-GFPではウイルスが作れるのに、pLenti-EF1alpha-Rfa-IRES-GFPではウイルスをかけた細胞でGFPが光りません。 トランスフェクトしたパッケージング293T細胞は光ります。 原理的にRfaのpolyAがあるので、そこで転写が止まってしまうのでしょうか？ わかる方いれば教えてください。

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