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(無題) 削除/引用 No.10429-6 - 2022/04/29 (金) 09:13:11 - game おおさま ありがとうございます。 リニアの場合、非常に形質転換効率が低く、プレートに生えてくる割合は非常に低いのですね。普通にしっかり生えている場合、環状のものが生えていると考えてよさそうですね。 ＞大腸菌もアンピシリン耐性のものです。 ↑すみません、こちらは、「ベクターもアンピシリン耐性です」の間違いです。

(無題) 削除/引用 No.10429-5 - 2022/04/29 (金) 05:06:55 - おお 直鎖のプラスミドは非常にTransformation効率が低いです。 クローズドサーキュラーで１ugにつき少なくとも１０＾７個（商品として売っている謳い文句的にはこれより１０倍以上）のコロニーがコンピテントセルからできます。 直鎖のプラスミドはたまにTransformationのネガコン（あるいは切れ残りチェックなど）で使われ、しっかりした系で数十ngを導入しても１０個あるかないかです。クローズドサーキュラーなら１０＾５個以上のコロニーが生えるはずです。 オープンサーキュラーはクローズドサーキュラーより少しTransformation効率は落ちますが直鎖ほど低くならないので、 直鎖がほとんど生えないような条件でTransformationすれば目的のプラスミドをもったコロニーがドミナントに生えてくるということです。 インサート配列だけのばあい普通は抗生物質耐性をコードした遺伝子はないですし、大腸菌内で複製に必要なDNA配列（Ori）もないですからオープンサーキュラーやクローズドサーキュラーになっても大腸菌内で維持されません。もし維持されるならプラスミドを使わず目的の遺伝子を環状にして大腸菌に入れればいいことになります。 ＞大腸菌もアンピシリン耐性のものです。 このくだりがよくわからないですが、、、大腸菌に入れるプラスミドのアンピシリン耐性遺伝子がのっていて、それを入れる前の大腸菌はアンピシリンがあると増えないというやり方なので、、、

(無題) 削除/引用 No.10429-4 - 2022/04/29 (金) 01:50:24 - game G25さま　おおさま ありがとうございます。大変参考になります。 そうしますと、 in fusionに成功した一部が形質転換され、プレート上でコロニーを形成するかと思いますが、linearのまま残ったベクターやインサート配列だけを含んだ大腸菌はコロニー上では増えないと考えてよいでしょうか。 つまり、しっかりと環状を形成したプラスミドを保持する大腸菌だけが増殖できるのでしょうか。 使用している抗生物質はアンピシリンで、大腸菌もアンピシリン耐性のものです。

(無題) 削除/引用 No.10429-3 - 2022/04/29 (金) 01:14:24 - おお 1200bpと5000bpがつながったとしてもオープンサーキュラーなら6200bpよりもおそらくかなり高い位置にくるとおもう。 一箇所だけつながっている状態で流れたなら6200bpぐらいに来るだろうけど。 すでに指摘がありますが、うまくつながった極微量のもので十分なわけだから見えなくてもおかしくはないと私も思います。ただ、Ligationの場合はなかなか目的のものが取れないのでマイクログラムオーダーでLigationして電気泳動で未反応のフラグメントを除いたりという荒業は聞いたことがあるような気がする。

(無題) 削除/引用 No.10429-2 - 2022/04/28 (木) 21:59:43 - G25 in-fusionにしてもligationにしても、狙い通りに環状化した分子なんてごくわずかで、ほとんどは元のフラグメントか副産物の重合体ばかりしか見えないと思う。 形質転換効率から考えても、そんな目に見えるほどの環状化プラスミドがあるとは思えない。 逆に見えなくてもちゃんと取れる時は取れるだから。検出限界から３桁は低いpgもできてれば数百個はコロニーが生える計算だもの。 私は、ligation, in-fusion を電気泳動するのは無駄だと思っている。

in fusionによるテンプレートを電気泳動した場合 削除/引用 No.10429-1 - 2022/04/28 (木) 20:29:18 - pko インサートをベクターに挿入する際に、in fusionシステムを利用して行なっています。 ベクターが5000bpくらいでインサートが1200bpくらいないのですが、infusion反応後のサンプルを電気泳動チェックした場合、およそ6200bpの環状ベクターとして現れるでしょうか？それとも、1200bpと5000bpのそれぞれlinerバンドとして現れますでしょうか？素人質問申し訳ありませんが、教えて頂けると嬉しいです。 宜しくお願いします。

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