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大腸菌の蛍光染色について トピック削除
No.10423-TOPIC - 2022/04/26 (火) 19:29:50 - 通りすがりの高専生
大腸菌の蛍光染色をDAPI、PI、CTCで染色、蛍光顕微鏡で観察したいのですが、上手く染色できておらず、蛍光が見えません。何か心当たりがある方は共有していただけると幸いです。
　
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No.10423-4 - 2022/04/27 (水) 09:32:53 - toto
菌体を冷凍庫で−20度くらいに冷やしたメタノールに冷凍庫で数分つけて、あとはとりだして室温でＰＢＳであらって、それらの蛍光試薬で染めて、ＰＢＳ等で洗いながせば見えますよ。ただ、よく見るには少なくとも60倍、できれば100倍の対物レンズで油浸が必要です。それでも菌体内の構造はあまりよく見えませんが、菌全体は十分はっきり見えます。

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No.10423-3 - 2022/04/27 (水) 09:22:21 - G25
>DAPI, PIに関しては生細胞と固定細胞で染色を比較すると確かめられる。

固定のしかたにもよるけれど、単にフォルムアルデヒドなどで固定しただけじゃ染まりにくいかもしれない。アルコール、アセトンなどの有機溶媒または界面活性剤で処理して脂質膜を壊すとよく染まる。

(無題) 削除/引用
No.10423-2 - 2022/04/26 (火) 20:59:05 - G25
生細胞か固定前処理済みの細胞か？
CTCは生細胞染色のはずなので、それを前提に、

DAPIやPIは生細胞には浸透しにくい上、多剤排出系で細胞内から排除されるので生細胞の染色には向かない。生細胞を染めているなら染まらないのはそのせいであろう。DAPI, PIに関しては生細胞と固定細胞で染色を比較すると確かめられる。なお、濃度を上げると(細胞毒性を示すくらい)、ある程度、生細胞でも染色が観察できる。
CTCが染まらないのは、例えば試薬がへたっているとか？

大腸菌の蛍光染色について 削除/引用
No.10423-1 - 2022/04/26 (火) 19:29:50 - 通りすがりの高専生
大腸菌の蛍光染色をDAPI、PI、CTCで染色、蛍光顕微鏡で観察したいのですが、上手く染色できておらず、蛍光が見えません。何か心当たりがある方は共有していただけると幸いです。
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