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(無題) 削除/引用 No.10421-7 - 2022/04/26 (火) 15:25:21 - G25 DNaseがコンタミしているように見えます。 HバッファーでMg++が供給されて活性化したんでしょう。 どのような方法でminiprepしたんでしょうか？ 今の精製産部をPCI抽出でもするかDNAクリーンアップ用のカラムをかければ解決すると思います。 簡単には、65-70℃10-20ほど加温して夾雑しているヌクレアーゼを失活させるのでもいいでしょう。 私はPCI抽出なしのAlkali/SDS法やボイル法でとったプラスミドはアルコール沈殿のあと溶解するときにそのようにして熱処理しています。それだけで分解を防ぎ安定性がぐっと良くなります。

(無題) 削除/引用 No.10421-6 - 2022/04/26 (火) 13:50:22 - おお 原因、どこで持ち込んだはともかくDNaseのコンタミが濃厚です。フェノクロで除たんぱくするのが昔の常套手段ですが、PCR Purificationキットなどにのっけって更に精製してもいいでしょう。 念の為溶かす水など新しいものを使うようにするといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10421-5 - 2022/04/26 (火) 13:25:35 - 中年 すみません、言葉足らずでした。 ×「普通はほとんど問題ないのですが」 ○「endA株であればフェノール抽出なしで普通はほとんど問題ないのですが」

(無題) 削除/引用 No.10421-4 - 2022/04/26 (火) 13:23:34 - 中年 フェノール抽出等の除タンパクはされていないということですね。普通はほとんど問題ないのですが、大腸菌の生育が悪くなるようなプラスミドを増やした場合にたまにヌクレアーゼのコンタミが気になることもあります。 今回に関しては制限酵素バッファーを加えるまでは分解が起こっていないので、今お持ちのプラスミド標品をフェノール抽出して再度エタノール沈殿するか、面倒であれば65℃で30分ほどインキュベートしてコンタミしているヌクレアーゼを失活させれば改善するように思います。 別の可能性として、TEがコンタミしているのかもしれません。私自身は経験がありませんし、こんなものを喰って増えるバクテリアなんていないだろうと思っていましたが、一人の学生がそれでしばらく困っていたことがありました。

(無題) 削除/引用 No.10421-3 - 2022/04/26 (火) 13:12:41 - K 中年様 早速のコメントをいただき、感謝申し上げます。 菌株名はXL10 goldになります。 調べたところ、The strain is endonuclease deficient (endA)と書かれてありましたので、それが問題ではないのかもしれませんね。。 miniprepは自作のP1 (+RNAse), P2, P3後にエタチンしています。 ペレットはTEで溶解しています。

(無題) 削除/引用 No.10421-2 - 2022/04/26 (火) 12:57:44 - 中年 大腸菌由来のヌクレアーゼということになりますが、クローニングに用いたホストの大腸菌株は何でしょうか。また、mini prepはどのように行っておられますか（カラムなどをお使いでしょうか）。 endA+の大腸菌株ならその産物がいちばん怪しいところです。

制限酵素後のバンドのスメア 削除/引用 No.10421-1 - 2022/04/26 (火) 11:41:42 - K いつも拝見させております。 大変稚拙な内容で恐縮ですが、ご意見聞かせていただけますと幸いに存じます。 pLVX-Puroへの700 bpインサートのBamH1サイトへのクローニング中ですが、大腸菌コロニーのmini prep産物をBamH1 in buffer H (Toyobo)で消化し、物が切り出されるかを確認したところ、予想外にバンドがスメアになってしまいました。 そこで原因を究明するため以下のものを用意しました。 1. そのmini prep産物1 ulを水9 ulに希釈し、37度で一時間処理 2. そのmini prep産物1 ulを水8 ulに希釈し、Buffer H 1 ulを加えて、37度で一時間処理 3. そのmini prep産物1 ulを水7 ulに希釈し、Buffer H 1 ulを加えて、BamH1 1 ulを加えて、37度で一時間処理 その結果、2と3で明らかなスメアが確認されました。 1では3本ほどのQCやOC、CCCなどが見られますが、2, 3でほぼ完全にスメアになっていました。 そこでbuffer Hに何か酵素(Dpn1など)？が含まれてるのかを疑い、オリジナルなpLVX-Puroの【midi】prep産物を同様にBuffer H 1 ulとBamH1 1 ulを加えて37度で一時間処理したところ、当然といいますか、予想される分子量にシングルバンドが綺麗に見えました。 以上のことから、このスメアの現象は私が今持つ、miniprep産物特異的なものと思われます。 ただ考えられる原因がわからずに困っています。 同様な現象をお持ちの方がいらっしゃいましたら、ご意見をいただけましたら幸いです。 よろしくお願いいたします。

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