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(無題) 削除/引用 No.10417-16 - 2022/04/26 (火) 01:31:29 - おお みなさんが指摘されていることについて異論はないのですが、特殊な例にスポットを当てすぎているような気がします。 まずエクソソームに存在するものは、細胞のLysateに存在するであろうからLysateで検出できるのであれば膜の転写効率がその蛋白において特に悪いとかすりぬけるということより違った問題点があるのではないかと思います。 まず、２０ugでしたっけ？を載せていてぽんぞーで染まらず、ゲルにもCBBでは残っていないのであればたんぱく質の見積もりに難点があるのかもしれません。Lysatesなどより脂質成分もおおく見積もりにブレが出ているのかもしれません。また血清たんぱくの持ち込みにより実質エクソソーム由来のたんぱくがあまりない状態の可能性もありますが、その場合７０kDaにどかっとバンドが見れるバズです（BSAのバンド）。 エクソソームを使った経験は皆無に等しいのでなんとも言えませんが、回収したものを丁寧にあらうとか注意して、更にたんぱく定量についてもどれがベストなのか探って見る必要があるかもしれません。おそらくRIPAを使っている時点でBCAなのだと思いますが。いきなりLysisせずPBSで懸濁したじょうたいでBradfordで定量してからRIPA等量加えるという手もとれるでしょうし、RIPAにこだわらずそのままSample bufferを加えてもいいでしょう。あるいは脂質などの成分を極力除くためにアセトンでたんぱくを除くというのもありかもしれません（Cell lysatesなら再溶解しにくい場合が多いですが、エクソソームの場合はよくわかりませんので経験者がいればいいのですが）。 エクソソーム内のたんぱくについてはそれを証明するためにプロテアーゼが使われたりします。一つのアイデアではありますが、プロテアーゼ処理をしたあとまた遠心して回収してたんぱく定量となるとわざわざ処理しなくても単純に洗うということで済むんじゃないかと思ってしまいますし、プレパレーションや考えている実験において膜がどれほどインタクトなのかが明らかでないと少し怖いです。腕が悪いのかもしれませんが一度トリプシン処理して集めた細胞を（確かトリプシンを中和したと思う）WBしたところ、細胞膜の内側にあるとされるたんぱくが見事に分解されていたことがあります。膜に埋まっているようなたんぱく質を解析するのにはプロテアーゼ処理は使えません。WBメンブレンを使用後保存しておいてなんらかの理由でそういうたんぱくを見る必要があるかもしれないというのであればしないほうがいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10417-15 - 2022/04/24 (日) 23:02:43 - rtyui exosomeの研究はやったことないですが、たぶんコンタミする大量の血漿タンパク質を分解除去するためと思います。エキソソーム内は膜で隔離されているので、プロテアーゼによる分解を受けることはないことを利用して、exosome外のタンパク質だけを選択的に分解除去することを意図して行われるものと推察します。(このような方法は骨格筋や心筋からミトコンドリアを精製するときによく行います)。 ですので、用が済んだ後のproteinaseの除去もしくは完全な不活性化は重要で、もしproteinase活性が残存した状態でexosomeを壊せば、当然まずいことになると思います。 培養細胞の場合は血漿と比べたらタンパク質の量自体が桁違いに少ないので、proteinasem処理は必要がないものと思います。

(無題) 削除/引用 No.10417-14 - 2022/04/24 (日) 22:49:55 - み >[Re:13] トマトさんは書きました : > み様 > > 血液凝固因子がポリマー法でのエクソソームの単離を阻害するようです。 > プロテアーゼを使用した方法でもタンパク質の検出をしている論文はありますので私のトラブルシューティングとどう関係してくるか分かりませんが、検証する必要はありそうです。 血液凝固因子が邪魔するなら、血餅除いた血清状態にしてからエクソソーム回収できないのかな？培養液からは回収できていて血液からが駄目なんだから、回収方法を見直すべきなんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.10417-13 - 2022/04/24 (日) 22:01:27 - トマト み様 血液凝固因子がポリマー法でのエクソソームの単離を阻害するようです。 プロテアーゼを使用した方法でもタンパク質の検出をしている論文はありますので私のトラブルシューティングとどう関係してくるか分かりませんが、検証する必要はありそうです。

(無題) 削除/引用 No.10417-12 - 2022/04/24 (日) 21:51:41 - み >[Re:10] トマトさんは書きました : > 血漿エクソソームは20マイクロg、培養液エクソソームは2マイクロgのタンパク質をアプライしました。 > タンパクの分解で思い出しましたが、エクソソーム回収の際にプロテアーゼを使用していました。 > そちらも関係があるかもしれません。 プロテアーゼインヒビターでなく？ プロテアーゼ処理すれば蛋白が切断、分解されてwesternで検出できないのはあたりまえではないかと。 プロテアーゼの切断部位、特異性が不明なので詳細は分かりませんが。 エクソソーム取得するためにプロテアーゼ処理する必要あるのですか？ 私はエクソソームを取り扱ったことないので理解できません。

(無題) 削除/引用 No.10417-11 - 2022/04/24 (日) 20:56:10 - トマト （培養液からエクソソームを回収する際には使用していません）

(無題) 削除/引用 No.10417-10 - 2022/04/24 (日) 20:54:31 - トマト G25様、み様 ありがとうございます。 CBB染色はやってみたいと思います。 原理的には可能性は低いとは思いましたが、やはり材料によって転写の至適時間が変わることは考えにくいのですね。 rtyui様 血漿エクソソームは20マイクロg、培養液エクソソームは2マイクロgのタンパク質をアプライしました。 タンパクの分解で思い出しましたが、エクソソーム回収の際にプロテアーゼを使用していました。 そちらも関係があるかもしれません。（培養液からエクソソームを回収する際に 皆様ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10417-9 - 2022/04/24 (日) 20:33:59 - rtyui 超高分子量タンパク質や強塩基性タンパク質のようにタンパク質によっては転写されにくいものはあります。また分子量10000を下回るのものだとポアサイズ0.45μmのメンブレンに保持するのは困難です。もしexosomeのproteomeがそうした性質を有する特殊なものであれば、お考えのようなこともあるのかもしれません。ただこのような偏りのあるタンパク質ばかりからなる珍しい生物材料を経験したことがありません。 で、私は、exosomeの単離の過程がアレで、十分量のexosomeが得られていないand/or 純度が低すぎということではないかと推察するのですが、そういう結論ではダメでしょうか。 泳動されたタンパク質量はwellあたりどのくらいですか。同量をアプライして細胞培養液由来のexosomeと比較されているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10417-8 - 2022/04/24 (日) 20:11:10 - み G25さんが指摘しているように転写せずゲルをCBB染色すべきでしょう。 蛋白濃度を反映する量が実際に存在するのか？本当に低分子領域は蛋白が多く存在するのか？膜上でポンソー染まらず、westernでもマーカーすら検出されないのだから、血漿由来エクソソームは正しく濃縮されていない、取得できていないのでしょう。取れていたとしても分解傾向にあるのでは？ あと血漿中にターゲットやマーカーと設定している蛋白が本当に含まれるかも別の問題として残されているかも。 既存の結果はそのように示していると思う。

(無題) 削除/引用 No.10417-7 - 2022/04/24 (日) 17:43:01 - G25 定量である程度の量があったとしても定性的な情報（タンパク質分子量の分布であるとか、intgrityとか、分解してるかもよ）がないのでポイントが絞れないですね。やはりまずCBB染色してみてほしい。 材料によって転写の至適時間が変わったりする（タンパク質の種類によってというのならいざしらず）という、あまりありそうにないことを疑う前に見ておくことはまだあるんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10417-6 - 2022/04/24 (日) 17:10:11 - トマト み様 ＞細胞total lysateでエクソソームタンパク質や標的タンパク質が検出できているなら検出系は問題ないと言えるがその辺りは？ 細胞培養液から単離したエクソソームは問題なく検出できましたので、検出系は問題ないです。 今回上手くいっていないのは血漿から単離したエクソソームです。 ＞そもそもエクソソームが採れていない可能性は？ NanoSightなどで測定していないので何とも言えません。ただ、commercialなポリマー沈殿法の試薬を使用しており、全く取れていないとは思えません。 今回はそもそもタンパク質がメンブレンに転写しないのが問題です。 サンプルの種類によって転写しやすい、しにくいがあるのでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.10417-5 - 2022/04/24 (日) 17:05:07 - トマト G25様 >転写していない状態でのCBB染色像の情報がほしいところ。 メンブレンはポンソーはそんなに感度高くないし、実はもともとそんなにタンパク質の量が多くないのかも。 それはその通りかもしれません。ですが、BCA Assayで3マイクロg/マイクロlあったのでそこまで少ないとも思えません。。。 転写は標準的なトリスグリシンのバッファーに10%メタノールを加えたものを使用しています。ゲルの平衡化は行っていません。 メンブレンはミリポアのPVDFを使用しています。 100kDaと50kDa程度のタンパク質を検出できればよいです。

(無題) 削除/引用 No.10417-4 - 2022/04/24 (日) 12:57:28 - み >[Re:1] トマトさんは書きました : > もちろんエクソソームマーカータンパク質も検出できず。 細胞total lysateでエクソソームタンパク質や標的タンパク質が検出できているなら検出系は問題ないと言えるがその辺りは？ そもそもエクソソームが採れていない可能性は？

(無題) 削除/引用 No.10417-3 - 2022/04/24 (日) 09:35:01 - G25 >ちなみにゲルをCBB染色で見てみましたがタンパク質は残っていませんでした。（ポジコンを取っていないので信憑性はそこまでないかもしれません） 転写していない状態でのCBB染色像の情報がほしいところ。 メンブレンはポンソーはそんなに感度高くないし、実はもともとそんなにタンパク質の量が多くないのかも。 あるいは低分子量のタンパク質が大部分を占めていて（もともと低分子量、あるいは分解して）、転写のときメンブレンを通り抜けているのではないかと疑います。 特にウェットトランスファでは、タンパク質の性質、あるいは分子量によって、転写効率やメンブレンへの吸着率の違いの影響が大きいようです。 目的に応じた転写バッファー組成やメンブレンの選択が必要になることも。 低分子量だとメンブレンの種類、ブランド、によっては、あるいは転写バッファーの組成、例えばSDS含有などで、スッポ抜ける場合があります。転写バッファー自体にSDSを含まなくても、転写前に転写バッファーに十分平衡化しておかないとゲルに含まれるSDSが影響します。 ちなみにどのようなものを使用しましたか。

(無題) 削除/引用 No.10417-2 - 2022/04/23 (土) 23:06:17 - トマト 追加情報です。 ケミルミでタンパク質を検出した際、ノンスペバンドが出てきたのと、タンパク質が流れた跡（伝わりますか？）が出てきたので全くタンパク質の転写がなされていないという訳ではなさそうです。

ウエスタンブロットで転写がうまくいかない 削除/引用 No.10417-1 - 2022/04/23 (土) 23:00:31 - トマト 特定のサンプルのみ転写がうまくいかず、困っています。（具体的にはエクソソーム） 他のサンプルは同時にタンパク質の検出まで上手くいっているので、根本的な手技の問題ではないと思っています。 PBS:RIPA Buffer = 1:1に溶解したエクソソームをSDS-PAGEで分離した後（20µg程度）、ウェット式で転写しています。 ところが、メンブレンはポンソーでほとんど染まらず。。。（同時に流してた他のサンプルは染まりました） もちろんエクソソームマーカータンパク質も検出できず。 サンプルによって転写の至適時間が変わったりすることはあるのでしょうか？ 実際のところ、低分子領域ではうっすらポンソーでバンドが見えたので転写時間を調節すればうまくいく可能性はあります。 ちなみにゲルをCBB染色で見てみましたがタンパク質は残っていませんでした。（ポジコンを取っていないので信憑性はそこまでないかもしれません） 転写時間をものすごく伸ばせばいいのか分かりませんし、他に根本的なミスをしているのか分かりませんがご意見いただけますと幸いです。

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