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(無題) 削除/引用 No.10416-8 - 2022/04/26 (火) 02:37:46 - game G25さん　おおさん ありがとうございます！ 大変参考になりました。助かりましたm(__)m

(無題) 削除/引用 No.10416-7 - 2022/04/26 (火) 01:45:34 - おお G25さんがすでに書かれていますが、ベクター側が脱りん酸化（フォスファターゼ処理）されてなければ、ベクター側からPCRProductsへの結合は可能です。PCR Products側からのLigationはリン酸がないので不可能ですから結果として環状（ニックが入った状態ですが）の物ができます。ニックが入った状態であってもそこそこTransformation活性があるので（ニックは大腸菌内で修復される）、目的のプラスミドを取ることができます。

(無題) 削除/引用 No.10416-6 - 2022/04/25 (月) 11:14:48 - G25 ベクター側の3'側とPCR産物の5'側はどちらもリン酸化されていないのですが、こちらも問題ないでしょうか？ もともと3'がリン酸化された状態というのはありません。 3'-OHと5'-リン酸基がエステル結合するのです。 TA-cloningの場合は、ベクターの5'-リン酸基とPCR産物の3'-OHがエルテル結合します。 ベクター側の3'末端-OHとPCR産物の5'末端-OHはライゲーションせずにnickのまま残ります。

(無題) 削除/引用 No.10416-5 - 2022/04/24 (日) 10:40:12 - G25 古典的な制限酵素、ligaseを使ってプラスミドベクターにインサートをクローニングする場合でも、セルフライゲーションを防ぐためにインサートを脱リン酸化しますね。それでも形質転換はできてプラスミドを増殖することができます。それとおんなじこと。 脱リン酸プラスミドにインサートをライゲーションすると、一方の鎖は共有結合で連結されますが、相補鎖側はリン酸基がないために連結できずnickが残ります。形質転換に必要なプラスミドコンストラクトは完全に共有結合で連結して環状化している必要はありません。一方の鎖にnickやgapがあっても、連続している相補鎖に対合すれば環状が保てます（open circular)。 これが生きた大腸菌に入れば、大腸菌の修復系や複製系がちゃんとnickやgapを埋めてさらにtopo2が螺旋を強めて、生理的なプラスミド(ccc)に仕上げてくれます。 in-fusionはligationの過程を含みません。末端に相補な一本鎖突出を作って水素結合で対合させているだけです。nickやgapがあるopen circularな中間体を大腸菌に入れて大腸菌に仕上げをしてもらっているのです。

(無題) 削除/引用 No.10416-4 - 2022/04/23 (土) 11:04:34 - game おおさん　totoさん ご返信ありがとうございます。 in fusionの場合、リン酸化の有無は関係なかったのですね！ ありがとうございます。 仮にもしなのですが、TベクターでPCR産物を組み込む場合は(in fusion使用せず普通のライゲーション反応で)、ベクター側の3'側とPCR産物の5'側はどちらもリン酸化されていないのですが、こちらも問題ないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10416-3 - 2022/04/23 (土) 10:28:12 - toto in fusionで入れるのであれば、ベクター末端のリン酸化の有無は関係ないですよ。相同性だけです。

(無題) 削除/引用 No.10416-2 - 2022/04/23 (土) 04:58:35 - おお オープンサーキュラーを作って大腸菌内の酵素群を頼りに結合させるんじゃなかったっけ。

クローニングの際のリン酸化について 削除/引用 No.10416-1 - 2022/04/23 (土) 03:01:08 - game クローニングの際に疑問点がございまして、素人質問になりますが、以下どなたがご教授いただけるとありがたいです。 ある発現ベクターのMCSにインサートを組み込んで、クローニングを行う予定です。ベクターは、MCS内の二種類の制限酵素(EcoRIとSalI)で切断する予定で、インサートは、in fusionで組み込む予定ですが、二種類の制限酵素配列に合わせた配列をプライマーに付加させて、PCRを行います。 ここで疑問なのですが、制限酵素で切断したベクター側の5'末端はリン酸化されているかと思いますが、インサートはPCRベースで伸ばしているので、5'も3'もリン酸化されておりません。この場合、インサートを組み込むことは可能でしょうか？ ベクター側の5'とインサート側の3'は結合しますが、ベクター側の3'と、インサート側の5'はどちらもリン酸化されていないので、結合しないのではないでしょうか。素人質問になりすみません。 どうぞよろしくお願いいたします。

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