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(無題) 削除/引用 No.10415-15 - 2022/04/28 (木) 09:26:34 - ななし 中年さま 貴重な情報ありがとうございます。 大変勉強になりました。自分でもやってみます！

(無題) 削除/引用 No.10415-14 - 2022/04/27 (水) 12:28:42 - 中年 うちで出回ってるプロトコルには「抗ペプチド抗体実験プロトコール」という古い本（懐かしの細胞工学別冊）が引用されていましたが、似たようなプロトコルは外でも見つかると思います。たとえばこれ。 https://www.cytivalifesciences.co.jp/technologies/ettan_dige/dojo03_03.html 細胞工学別冊にあったプロトコルは次のとおり。 細胞を氷冷PBSで洗う 10% TCAをかけて氷上で15分 スクレーパーで掻き取って1.5 mLチューブに移し、遠心して上清を除く（ここで長く置きすぎない方が良いらしい） 沈殿（10^7 cellsまで）を100uLのSDS dyeに懸濁して軽くソニケーション 2M Trisを少量加えてBPBの色を指標に中性に戻して5分間ボイル うちでは6M 尿素と各種阻害剤を入れたSDS dyeを使う場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.10415-13 - 2022/04/27 (水) 09:22:00 - ななし 横からすみません。 中年さまのタンパク質抽出法に大変興味があります。 差し支えなければ詳細なプロトコルか、または参考文献をご教授いただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10415-12 - 2022/04/27 (水) 04:06:34 - おお >[Re:11] bkjんlkさんは書きました : > 20S proteasomeなどでもそうした機序で低濃度SDSで活性化させる方法が昔からありますが、高濃度になれば普通に失活します。 20S proteasomeの場合はデーターを見たことがありますしおっしゃっていることは理解できます。 ですが、「高濃度になれば普通に失活します」というのは内在性フォスファターゼに関して直接的根拠がありますか？サンプルバッファーで処理したサンプルでさえ、それなりの期間保存しておくとなんだか分解しているような気がしたりしますし、４度で保存という話も聞かないので（プロテアーゼの話ですが）、高濃度SDS＝失活は危険な方程式のような気がします。まあ私も大丈夫だろうと根拠なく思っていましたが、TCAなどで一気に変性させたほうがうまくいくという話も出ましたので。

(無題) 削除/引用 No.10415-11 - 2022/04/26 (火) 15:18:53 - bkjんlk それはphosphataseがSDS耐性ということではなくて、ごく低濃度のSDSによって局所的な高次構造の変化が誘導された結果、活性化が促進されたのではないでしょうか。20S proteasomeなどでもそうした機序で低濃度SDSで活性化させる方法が昔からありますが、高濃度になれば普通に失活します。

(無題) 削除/引用 No.10415-10 - 2022/04/26 (火) 07:37:43 - 中年 実例と言えるかどうかわかりませんが、ウエスタン上のバンドシフトがリン酸化に由来することを示すためにサンプルをBAP処理（今だとlambda PP）する実験で、脱リン酸化が不十分なときには濃度を振って薄いSDSを入れたりしていました。ホスファターゼの失活はもちろんあるのだと思いますが、こういう消化酵素みたいなホスファターゼは丈夫にできてるなあという印象です。 理由はともかく、TCAで固定するようになってからシグナルの強さも安定度も格段に上がり、リン酸化を検討する場合のファーストチョイスにしています。

(無題) 削除/引用 No.10415-9 - 2022/04/26 (火) 01:38:36 - おお >[Re:5] 中年さんは書きました : > SDSで部分的に変性したようなタンパク質はホスファターゼにとって絶好の基質となるので、 実例はありますか？興味があります。 フォスファターゼも部分的に変性していると思うしどうなんでしょうか。プロテアーゼにはProKなどSDS耐性のものがありますけど。まあRIPAにフォスファターゼInhibitorを加えた状態でも完璧かと言われればどうかなと思うふしはありますけどね。

(無題) 削除/引用 No.10415-8 - 2022/04/25 (月) 13:40:42 - 中年 サンプル調製後は通常のウエスタンと比較して特別な工夫はしていません。 ホスファターゼの阻害剤はものによってはリン酸化エピトープと競合してしまうでしょうから、感度低下の原因になりそうです。 環境中のバクテリアは消化酵素のようなホスファターゼを分泌しているでしょうから、あまり古いバッファーなどは使わない方が良いと思いますが、通常のウエスタンがきちんと動いているラボなら問題にはならないように思います。

(無題) 削除/引用 No.10415-7 - 2022/04/25 (月) 13:05:43 - LPS 中年さんにお伺いしたいのですが、弱いリン酸化を検出する際に、転写後の操作で特別なこと（例えば、ブロッキングも洗浄も低温で行うとか、洗浄液やブロッキング液にも阻害剤を入れるとか）をやられていますか？ もし、やられているのであれば教えて頂きたいです。

(無題) 削除/引用 No.10415-6 - 2022/04/25 (月) 12:07:48 - 中年 すみません、ちょっと勇み足な記述でした。 量の多いタンパク質がストイキオメトリックにリン酸化されている場合など大丈夫なケースもあると思いますが、弱いリン酸化を検出するのは難しい、くらいに割り引いて読んでください。

(無題) 削除/引用 No.10415-5 - 2022/04/25 (月) 12:05:14 - 中年 SDSで部分的に変性したようなタンパク質はホスファターゼにとって絶好の基質となるので、よほど急速な溶解→ボイルをしていないかぎり残念ながらリン酸化エピトープはかなり失われてしまっていると思います。うちではこの手の実験をするときには、氷冷したPBSなどで細胞を洗浄した後、プレート上でタンパク質をTCAで固定してしまい、その後ウレアを含んだバッファーで溶解したものをゲルに流します。

(無題) 削除/引用 No.10415-4 - 2022/04/23 (土) 12:31:35 - LPS 抗体は、ターゲット上だけのリン酸化を検出できる抗体ですか？ 単純な抗リン酸化抗体を使うのであれば、免疫沈降してターゲットを絞る必要があると思うのですが、免疫沈降ができません。 また、免疫沈降でゲルにのせる量を増やして感度を上げることもできません。 量が十分で、特異抗体があるのならば大丈夫のように思えます。

(無題) 削除/引用 No.10415-3 - 2022/04/23 (土) 04:34:21 - おお リカバーしなくともそのまま流していいと思う。おそらく大丈夫だとおもう。 タンパク量は比較対象が同じ細胞のポピュレーションで、ほぼ同じ量のたんぱく質がとれていて、Overloadしたりしてない量だったらまあ大丈夫かなと思います。

(無題) 削除/引用 No.10415-2 - 2022/04/22 (金) 19:52:46 - cvTByふ 電気泳動の際に用いるsample bufferには強力なタンパク質変性剤であるSDSが高濃度で含まれていますので、この溶液の中では大部分の酵素はほぼ失活すると思います。なので、特に阻害剤を入れる必要は必ずしもないように思いますし、リン酸化など可逆的な翻訳後修飾の研究においては操作中の酵素的脱修飾を抑えるため直接SDS-sample buffer（注：BPBまだ入れない、還元剤もまだ入れない）で可溶化するのはむしろ普通です。もちろんそれで絶対に大丈夫とは言い切れませんが、protein phosphataseはたくさんありますが、特別にSDS変性に強いという話は私はきいたことがありません。sample bufferで可溶化するとクロマチン が解体してDNAによる粘性が高くなります。そのままで電気泳動すると、泳動パタンが乱れて汚くなるので、短時間の超音波処理あるいは一番細いゲージのシリンジで数回出し入れしてDNAを剪断して粘性がなくなってからタンパク質定量し、その後、BPBと還元剤を入れて、加熱して、泳動を行います。SDS含有試料に適さないタンパク質定量試薬（ブラッドフォールド法）もありますので、SDSがあっても希釈すればOKのもの（BCA法など）を選択してください。もしかして還元剤も入れてしまいましたか？還元剤あってもいけるタンパク質定量試薬はあることはありますが（BCAの変法）かなり限られます。リン酸化よりもこちらの方が少しきになります。 タンパク質変性作用の弱い可溶化液では酵素が働いてしまうので、できる限り低温に維持するとともに阻害剤の添加が必要です。もちろん、入れたから安心とは限りませんが、脱修飾のリスクはある程度まで減らせます。

リン酸化をウェスタンで検出する 削除/引用 No.10415-1 - 2022/04/22 (金) 19:10:19 - Cell リン酸化をウェスタンで検出したいと考えていますが、貴重な細胞を直接sample bufferに溶解してしまいました。。。 あとから調べると、phosphatase inhibitorなどいろいろ工夫があるようなのですが、もはやリカバリー不可能でしょうか？

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