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(無題) 削除/引用 No.10403-10 - 2022/04/22 (金) 02:34:10 - おお まあその事情とやらこちらではわかりかねますので、当事者がベストだと思う判断がベストなんだろうと思うしかありませんが、 そういえば今や細胞一個から発現プロファイルが見れる方法論も確立しているわけですから、９６Well plateで30分、1時間、6時間、12時間、24時間とかタイムコースとれるんじゃないかな。RNA-seq依頼先と相談するか、それができるところを探すかしてみてはどうでしょう。WBはそれからベストの時間を割り出せるだろうしそのあとでいいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.10403-9 - 2022/04/21 (木) 21:27:45 - あの たとえば細胞膜上のGPCRにリガンドがくっつくと、１秒未満で構造変化が起き、 細胞内のシグナル伝達機構が動くと思ってよいです。 mRNA発現だけなら、もっと短時間で変化すると思いますが、その場合でも Early response や、Late response など様々です。 それからタンパク発現の段階になる訳で、さらに検出系で有意差として見出せる時間 も考慮する必要があるわけです。 そのデータが自分だけ見るもので、論文化しないつもりなら話は別ですが、 論文化するつもりなら、論文投稿後にレフェリーとのやりとりによって いくらでも追加実験する必要が生じると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.10403-8 - 2022/04/21 (木) 16:18:27 - LIGAND 事情が複雑なのですが、そのタンパク質は入手ができません。 あくまで実験の一部なので、このタンパク質で1回で終わらせたいと考えています。 培養液に入れたタンパク質が分解してしまう可能性もあるのですかね。 FBSフリーにするためには、何度もwashして落とす必要があるんでしょうか。 8時間ですか、、、、うーん、エイヤーとやるにも勇気がいりますね。 培養細胞なら、数時間もすれば、いろいろ発現は変わりそうですよね。

(無題) 削除/引用 No.10403-7 - 2022/04/19 (火) 18:16:24 - Hi 占い師でないので、このくらいの時間がいいですよとはたぶん誰も自信持って言えないと思うので、結局、オーソドックスな条件検討はせざるを得ないのですが、試料に限りがあるという事情があるならば、残された方法は培養器材サイズ（プレート、dish, チャンバースライド)と培地量をスケールダウンしまくってやるということになると思います。 これまでのデータから当該リガンドの受容体下流の経路がある程度わかっているなら、その活性化を見ることである程度細胞のレスポンスをモニターすることができるのですが、その場合も、相応のサンプル量が必要になるWBやqPCRでなく、蛍光免疫染色で評価するとかすればスモールスケールの欠点を補うことができます。 そうした点を踏まえて実験系を工夫してみましょう。

(無題) 削除/引用 No.10403-6 - 2022/04/19 (火) 01:15:28 - おお >[Re:1] LIGANDさんは書きました : > 新規レセプターに対して新規のリガンドを同定しました。 > > 組み換えタンパク質リガンドで、培養細胞をインキュベーションしてから、RNA-seqやWBでの遺伝子発現解析を行う予定です。リガンドはサイトカインではなく、新規の内在性のタンパク質です（外部のタンパク質ではありません）。 > > 30分、1時間、6時間、12時間、24時間等がtime pointとして考えられますが、いつ細胞を回収するかを悩んでいます。こういう実験では、一般論として、いつ行うのが、いいのでしょうか。 > > 他の例を論文で検索すると、長時間インキュベーションすると逆にmRNA変化やタンパク質変化が落ち着いてしまう結果も見て取れるのですが、逆に増強される例も多くあります。 > まず、論文でいろいろな時間で見ているのが見つかるのは、それぞれ最適な時間が異なるから。逆に言うとあなたの実験の最適なTime windowはそういう論文を見ても参考にならないということです。 なのでなんとかして見つける必要があります。それか「えいやー」と決めつけでやってしまうか（それもある意味研究者のスタイルともいえる）。 組み換えタンパク質なら更になんとか作ることもできそうだし、作るための材料（プラスミドとか？）をもらって精製しても良さそうだけど。あるいは短いならペプチド合成とか。また、タイムコースなど取るとかいろいろな実験デザインを考えた上で、共同研究者とも話し合うことも必要なのではないでしょうか。 WBをやるつもりなのならターゲットの遺伝子など絞れてますよね。ならばそちらから何らかの情報を見つけることも考えれませんか？

(無題) 削除/引用 No.10403-5 - 2022/04/18 (月) 18:00:10 - あの それからWBやRNAseqは、12ウェルプレートの中の1ウェル程度で十分です。 ただしエタちんメイトなどを、RNA採取の際に必要で、低吸着グレードのチップやマイクロチューブが必要ですが。

(無題) 削除/引用 No.10403-4 - 2022/04/18 (月) 17:51:01 - あの 具体的にどのくらいの量のリガンドが、お手元にあるのかわかりませんが、 例えば、一般的なホルモンの血中濃度は、picomol/Lやnanomolar/Lです。 ただし培養実験で、これらの濃度で添加実験するならば、タンパク分解酵素等が入っているFBS等は 無い状態で、プロテアーゼフリーグレードのBSAに置き換えることを推薦します。 いずれにせよ、濃度の設定が一段階では、どのような濃度反応関係かわからないので、推薦しません。 培養液中の半減期とかの情報が無いならなおさらです。

(無題) 削除/引用 No.10403-3 - 2022/04/18 (月) 16:53:59 - LIGAND 返信ありがとうございます。 細胞膜上のレセプターです。 レセプター自体の研究はありますが、リガンドを添加した研究はありません。 mRNAやタンパク質がどれくらいのスパンで増強や減衰するのか、全く読めないのですが、文献によってフィードバックがかかるのか？1時間程度で実験が行われている例もあるようです。 8時間ですか。 とにかく与えられたタンパク質が少ないので、一発勝負に近い状態で、半分をRNA-seqに半分をWBに回そうと考えています。

(無題) 削除/引用 No.10403-2 - 2022/04/18 (月) 12:52:10 - あの もうちょっと情報ないと回答は困難ですが、、、 そのレセプターは、細胞膜上なのか、細胞質内や核内かにより 必要時間は長くなる。 本当にレセプターとリガンドの両方ともが、参考になる先行研究がないのですか？ もしそうなら、何が根拠で、レセプターやリガンドと判断したのかが疑問です。 という疑問は横においておくとして、、、 WBするつもりなら、抗体がすでにあるという前提でしょうから、 抗体のターゲットや、その上流にあるレセプターの情報を参考にする。 もし万一　一切の情報が無くて、WBもしたいという前提なら、 とりあえず8時間ぐらいで、当方ならやってみます。 これより短いと差が見られない可能性、これより長いとリガンドが壊れる可能性、 深夜に仕事したくない、などの理由です。

細胞をリガンドでインキュベーションしてからいつ回収するか 削除/引用 No.10403-1 - 2022/04/18 (月) 09:19:02 - LIGAND 新規レセプターに対して新規のリガンドを同定しました。 組み換えタンパク質リガンドで、培養細胞をインキュベーションしてから、RNA-seqやWBでの遺伝子発現解析を行う予定です。リガンドはサイトカインではなく、新規の内在性のタンパク質です（外部のタンパク質ではありません）。 30分、1時間、6時間、12時間、24時間等がtime pointとして考えられますが、いつ細胞を回収するかを悩んでいます。こういう実験では、一般論として、いつ行うのが、いいのでしょうか。 他の例を論文で検索すると、長時間インキュベーションすると逆にmRNA変化やタンパク質変化が落ち着いてしまう結果も見て取れるのですが、逆に増強される例も多くあります。 実は、このタンパク質は共同研究室からもらったもので、多数の予備実験を行えない状況です。 アドバイスをいただけないでしょうか。

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