Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

プラスミドサンプルのクリーンナップ トピック削除
No.10402-TOPIC - 2022/04/16 (土) 14:13:51 - ごはん
精製したプラスミドを酵素処理（制限酵素やPlasmid-safe DNase）を行い、その後DNAサンプルのクリーンアップを行っていますが、カラム精製の収量が悪くて困っています。

カラムはマッハライ・ナーゲル社のNucleoSpin® Gel and PCR Clean-upを使用しています。promegaのWizard® Plus SV Minipreps DNA Purificationも使用してみました。
収量はどちらも概ね1/5以下です。つまり15μgのプラスミドを制限酵素処理してカラム精製すると2μg程度になってしまいます。

キットの用途とは少しズレているためでしょうか？それともキット試薬の劣化や私の操作に問題があるのでしょうか？
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.10402-6 - 2022/04/18 (月) 14:43:09 - 774R
処理する前のプラスミドはどのような状態のものでしょうか？
RNAとかRNAの分解物とか含まれてるということはないですか？

(無題) 削除/引用
No.10402-5 - 2022/04/17 (日) 12:11:05 - おお
Plasmid-safe DNaseを使うことによってインタクトでないプラスミドが消化されたとか、Plasmid-safe DNaseを使ったあと活性がうまく除けてない状態で制限酵素処理をした可能性はどうでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.10402-4 - 2022/04/17 (日) 10:04:42 - おお
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up XS Binding capacity 5 ug
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Binding capacity 25 ug

https://www.takarabio.com/products/nucleic-acid-purification/dna-cleanup-kits/nucleospin-gel-and-pcr-clean-up

通常の１〜数mlのカルチャーのMiniprep（High copy のやつで）で２ugということはないだろうから、キャパはそれぐらいだと思う。
PCR clean-up kitなどは酵素処理などのあとの精製にもよくつ分かれているので、用途の問題ではないのではないかとおもう。

考えれることはいくらかあるが、
最初のDNAの見積もりが正確でない（細かく分解されたRNAなどが混じっているなど）。
キットのバッファーが劣化している。あるいは適切でない調製をした。

もしかしたら改善できるかもというところは、
さいしょDNAに混ぜるBinding用のBufferを多めに使う。
溶出のとき溶出用Buffer（多分水かTE）を２回に分けでつかう。

(無題) 削除/引用
No.10402-3 - 2022/04/17 (日) 08:49:24 - G25
製品仕様によると最大結合量は25 ugだそうだからキャパは十分なようです。

反応産物を精製して何に使うつもりなのか、それは収量が2 ugじゃ足りないのか？
ヌクレアーゼ処理の後の精製は多くの場合、不必要(熱失活、不十分な場合はEtOH pptやPCI)
2 ugも有れば大抵の実験には十分

能書き通りにカラムで精製できないのは問題かも知れないけど、そもそもその精製は必要なのか？
不必要な操作で労力やコストを増やすのも罪ですよ。

(無題) 削除/引用
No.10402-2 - 2022/04/16 (土) 15:19:21 - み
何の実験か分かりませんが、そもそもキットのキャパシティはどのくらいでしょうか？
2ugって結構な量ですよ。
精製くらいフェノールクロロフォルム抽出してエタ沈しておけば大抵の実験に適用できる。

プラスミドサンプルのクリーンナップ 削除/引用
No.10402-1 - 2022/04/16 (土) 14:13:51 - ごはん
精製したプラスミドを酵素処理（制限酵素やPlasmid-safe DNase）を行い、その後DNAサンプルのクリーンアップを行っていますが、カラム精製の収量が悪くて困っています。

カラムはマッハライ・ナーゲル社のNucleoSpin® Gel and PCR Clean-upを使用しています。promegaのWizard® Plus SV Minipreps DNA Purificationも使用してみました。
収量はどちらも概ね1/5以下です。つまり15μgのプラスミドを制限酵素処理してカラム精製すると2μg程度になってしまいます。

キットの用途とは少しズレているためでしょうか？それともキット試薬の劣化や私の操作に問題があるのでしょうか？
全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。