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(無題) 削除/引用 No.10395-7 - 2022/04/15 (金) 01:09:48 - タントピーシーアール あ、すいません。先に書いた方法、PCR産物の希釈液にも20bpのタグ無しプライマーが残っているので、完璧を期すならこれを取り除いた方が良いです（ゲルに流して目的産物だけ抽出するとか。昔は単純にPCR産物をエタノール沈殿するとか指導されてたけど、これって本当にプライマー除けてるんだろうか？）。

(無題) 削除/引用 No.10395-6 - 2022/04/15 (金) 00:55:14 - タントピーシーアール 1）タグ無しプライマーでならPCRがかかる 2）タグを付加したプライマーだとPCRがかからない これ、1）も2）も、テンプレートDNAに使ったのは細胞（または組織）より抽出したRNAから作ったcDNAじゃないですか？もしそうであれば、1）のPCR産物を50から200倍程度希釈したものをテンプレートDNAとして2）のPCRをかければ、多分あっけなく増えますよ。 1）のPCRを25ulの系でやったのなら、10ul位をゲルに流してPCRがうまくいってるのを確認して、残りの15ulからちょっと取って希釈（水で良いです。2ulのPCR産物＋198ulの水とか）してそれをテンプレートDNAとして2）のPCRを行うだけです。 おおさんが「20bpのプライマーで増やして精製してから長いやつでPCRする」と書かれているのと同じ指摘になるんですが、もしかしたらピンときてないかも、と思って書き込みます。既に試されていてうまくいってなかったのならごめんなさい。

(無題) 削除/引用 No.10395-5 - 2022/04/14 (木) 20:43:32 - kent おおさま、G25様、Neo様、 大変貴重なご指摘ありがとうございます。 確かにprimerの長さは同じ長さにしておりませんでした。 今までうまくいっていたのでそれほど気を付けなくてもよかったのですが、ご指摘いただいたように試してみます。 条件は58Cx30sec annealingで行っておりました。 enzymeはPhusion High-Fidelityを使っておりますが、別のHFもありますので、試してみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10395-4 - 2022/04/14 (木) 14:46:17 - Neo 酵素を変えてみると、あっさりうまくいくことがあります。 もし別のポリメラーゼがあれば、一度試してみるとよいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10395-3 - 2022/04/14 (木) 07:06:20 - G25 タグ付けPCRではおそらく N末側プライマー　20 nt C末側プライマー　40nt というインバランスでやることになると思うけど、サーマルサイクル、特にアニール条件はどう設定していますか？ そのPCRで増幅が見られなくても、一部を取ってもう一段階PCRをかけたらどうか？ C末側プライマーを5‘側20nt程度の適当な長さに揃えたものに変えて。

(無題) 削除/引用 No.10395-2 - 2022/04/14 (木) 04:45:54 - おお PCRの小手先てきなものであれば、ベタインをいれる。GCリッチ用添加物（多分ベタインとか入っている）を使ってみる。 タッチダウンとかしてみる。 酵素を変えてみる。 20bpのプライマーで増やして精製してから長いやつでPCRする。 外側の付け足す部分だけのプライマーを用意して、４０bpのプライマーで数サイクル回し更に外側の付け足す部分だけのプライマーで増やす。４０bpのプライマーを少量だけ入れて外側の付け足す部分だけのプライマーで増やしたりも同じような方法で取られていると思う。

PCRの問題 削除/引用 No.10395-1 - 2022/04/13 (水) 19:22:15 - kent お世話になります。 現在いくつかのコンストラクトを作成していますが、C末にタグをつけるコンストラクトがうまくいっていません。 この遺伝子はおよそ300bpでその5'と3' primer (20bp)で問題なくかかります。 これにC末タグ（およそ20bpでprimerの長さがトータル40bp)を付けると途端にかからなくなります。 別の遺伝子（600bp)でも同じことが起こります。目的遺伝子とのannealingは問題ないはずですので、おそらくprimerのstructureが問題なのではと思い、次にDMSOを入れることを考えていますが、他に何かお気づきの点がありましたらお教えください。

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