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(無題) 削除/引用 No.1037-20 - 2012/10/22 (月) 22:54:40 - おお > > で単に数が減るだけなんでしょうか。ポジの割合も変わりそうな気がしますが、、、 > > ポジの割合は増えますよ。だってプラスミドを保持した大腸菌が選択的に生存しやすくなるわけですから。 いや、インサートが入ったポジということで、、、 プラスみドが入ったポジはそんなに変わらないと思いますが、、、むしろ変にストレスをかけた分おかしなプラスミドが雑ざる可能性もあるかと、、、

(無題) 削除/引用 No.1037-19 - 2012/10/22 (月) 18:03:32 - 7744 > 結果としてCFUが下がるわけですから全体の方法論的には効率がわるい方法ということで、、、 全く持って同意です。 > 耐性遺伝子が発現してない状況で薬物にさらされる時の生理的状態とかもファクターになっていないと否定できないような気もしますし、、、 それはもちろん、否定できないというか、それなりにCFUに影響すると思います。 > で単に数が減るだけなんでしょうか。ポジの割合も変わりそうな気がしますが、、、 ポジの割合は増えますよ。だってプラスミドを保持した大腸菌が選択的に生存しやすくなるわけですから。

(無題) 削除/引用 No.1037-18 - 2012/10/22 (月) 17:41:00 - おお >[Re:17] 7744さんは書きました : > > しっかりした説明になってませんが、形質転換後の抗生物質なし培養をやらないばあいトランスフォーメーションの効率が落ちますね。 > > トランスフォームの効率が落ちるという表現はおかしいかと・・・。 > おそらくpre-cultureすることによって生き残る大腸菌が増えるから、生えてくる菌が増えるだけ。 えっと押し問答になっちゃうんですが、結果としてCFUが下がるわけですから全体の方法論的には効率がわるい方法ということで、、、あと、耐性遺伝子が発現してない状況で薬物にさらされる時の生理的状態とかもファクターになっていないと否定できないような気もしますし、、、 で単に数が減るだけなんでしょうか。ポジの割合も変わりそうな気がしますが、、、

(無題) 削除/引用 No.1037-17 - 2012/10/22 (月) 17:17:57 - 7744 > ええと、最初から一貫して「技術上の感覚的な話」ですので、厳密な実験は一切行っておりません。ご了承ください。おそらく、10倍以上効率が違うとは思いますが。（その上で、可能であれば最初の質問にお答えいただければ、と思います。） きっとトランスフォーに持ち込まれるベクターのモル数と、ベクターが大きいことによるトランスフォーム効率（プラスミドを保持する大腸菌の数）の低下の相乗効果。 １０倍以上違うということが、pre-cultureが実際の効率に影響しているという考えには結びつかない。 > しっかりした説明になってませんが、形質転換後の抗生物質なし培養をやらないばあいトランスフォーメーションの効率が落ちますね。 トランスフォームの効率が落ちるという表現はおかしいかと・・・。 おそらくpre-cultureすることによって生き残る大腸菌が増えるから、生えてくる菌が増えるだけ。 まずそもそも、得られるコロニーが増えるという現象と、効率が上がるという現象はイコールではないはずですが？ というか、pre-cultureで実際の効率（プラスミドを保持する大腸菌の数）が上がる（増える）なら、最初からコンピととプラスミドを培地中で混ぜても大丈夫と言っているのとほぼ同じ気がする・・・。

(無題) 削除/引用 No.1037-15 - 2012/10/22 (月) 14:07:51 - ンンノ >＞理由は、耐性遺伝子が転写翻訳されて細胞が薬剤耐性を獲得するまでの猶予期間ですよね？ >そうだとすると、簡単なコンストラクトであまり、抗生物質なし培養が必要な >いというところが説明できないのです。まったく定量的でないので、すみませんが。 大腸菌にだって細胞周期があるのでフェーズの揃わない細胞集団でコンピテ ントセルを作るわけで、遺伝子導入操作でプラスミドを取り込まされてすぐ に耐性遺伝子を発現する奴が少しくらいいてもいいんじゃない？

(無題) 削除/引用 No.1037-14 - 2012/10/22 (月) 02:21:01 - おお ケミカルこんぴテントではマンガンやルビジウムとか(コバルトもだったっけ)はいってますからねぇ。 カルシウムで入れる方法もあるみたいですが、その場合は希釈して効率がうんぬんより、もともと効率が悪いですし。。。 と思いついたことをつぶやいてみた。

(無題) 削除/引用 No.1037-13 - 2012/10/21 (日) 11:44:56 - おじさん >＞形質転換後の抗生物質なし培養をやらないでばあいトランスフォーメーションの効率が落ちます>ね。、、、 > >そういうことなのかも知れません。何かリペアかトランスフォーメーションの未知の因子があるのか>なあと思ったものですから。 すごい大昔に、細胞工学か実験医学で読んだ気がしますが、コピテントセル中の成分（Mgだったか何か)が、そのままの濃度だと大腸菌の生育によくないらしく、水でもいいから希釈してから撒けば効率が上がるということが書いてあったのを思い出しました。あまり本題とは関係ありませんが。

(無題) 削除/引用 No.1037-12 - 2012/10/21 (日) 09:58:55 - おお >[Re:11] 難しいコンストラクト作成さんは書きました : > ＞形質転換後の抗生物質なし培養をやらないでばあいトランスフォーメーションの効率が落ちますね。、、、 > > そういうことなのかも知れません。何かリペアかトランスフォーメーションの未知の因子があるのかなあと思ったものですから。 単純に思いつくのは直接こうせい物質のバイチに植えると、ストレスがかかりますので、、、

(無題) 削除/引用 No.1037-11 - 2012/10/21 (日) 09:55:48 - 難しいコンストラクト作成 >議論を「形質転換後の抗生物質なしの培地」に限定するのであれば、同一で あることが保証されているべきです。 ええと、最初から一貫して「技術上の感覚的な話」ですので、厳密な実験は一切行っておりません。ご了承ください。おそらく、10倍以上効率が違うとは思いますが。（その上で、可能であれば最初の質問にお答えいただければ、と思います。） ＞形質転換後の抗生物質なし培養をやらないでばあいトランスフォーメーションの効率が落ちますね。、、、 そういうことなのかも知れません。何かリペアかトランスフォーメーションの未知の因子があるのかなあと思ったものですから。

(無題) 削除/引用 No.1037-10 - 2012/10/20 (土) 11:16:31 - おお >[Re:7] 難しいコンストラクト作成さんは書きました : > みなさん、ありがとうございます。 > > >普通はすると思いますが、省略することも珍しくないかも。 > > 私は、ミニプレップのプラスミドについては形質転換後の抗生物質なし培養をやりません。コロニーはよく出てきます。このノリで、簡単なコンストラクトについてももやりません。これが難しいコンストラクト作成だと駄目なのです。 しっかりした説明になってませんが、形質転換後の抗生物質なし培養をやらないでばあいトランスフォーメーションの効率が落ちますね。難しいコンストラクトほど効率のよいトランスフォーメーションでないとなかなかポジが取れてこなかったりします。そのように考えるともう少し突っ込んだ考察もできそうですが、、、

(無題) 削除/引用 No.1037-9 - 2012/10/20 (土) 09:15:05 - Harmonia コンストラクトの難易度（インサートの長短）への依存を考えるとき、大腸 菌の中のことと外のことを分けたほうが良いです。 大腸菌に遺伝子導入する前の条件が、難しいコンストラクトと簡単なコンス トラクトで同一であるという条件でのお話でしょうか？ 議論を「形質転換後の抗生物質なしの培地」に限定するのであれば、同一で あることが保証されているべきです。 最初の書き込みで「有効」と仰った判断基準はコロニー数の比較でしょうか？ そのコロニーの数が、大腸菌にふりかけた（入りさえすれば菌に薬剤耐性を 与えることが理論的に期待できる）プラスミドの個数に比例していますか？ また、ふりかけたプラスミドを菌内に保持できた大腸菌の数はどうでしょう？ つまり入ったけどコロニー形成ができなかった数を知りたいのです。 ライゲーションがうまくいっているとはいえ、期待通りのものができたかど うかを確かめるのは困難と思います。 出来上がった難しいコンストラクトと簡単なコンストラクトのプラスミドの 同一モル数を使って、大腸菌の形質転換を行うときはどうでしょう？ふりか けた数と入った数が同一でないと議論できないという難点を含んだ問いであ ることは承知していますが。 ＞＞理由は、耐性遺伝子が転写翻訳されて細胞が薬剤耐性を獲得す ＞＞るまでの猶予期間ですよね？ ＞そうだとすると、簡単なコンストラクトであまり、抗生物質なし ＞培養が必要ないというところが説明できないのです。まったく定 ＞量的でないので、すみませんが。 長いと、プラスミドの複製に要する時間が長くなるので、いろんなイベント のタイムテーブルが間延びすると、感覚的におもいましたので、説明は可能 だと思います（私にはうまくできませんけど)。

(無題) 削除/引用 No.1037-8 - 2012/10/20 (土) 08:20:07 - おお >[Re:7] 難しいコンストラクト作成さんは書きました : > みなさん、ありがとうございます。 > > アンピシリンは菌を殺すのだとおもいます。（bactericidal　vs bacteriostatic）基本的に、抗生物質の種類は関係ない気がしています。 アンピシリンはどちらかといえばbacteriostaticです。カナマイシンはどちらかというとbactericidalではないかと。。。何となく種類に関係しそうですが、こうせい物質の種類に関係がないと思われるのはご自身のとらんすふぉーめーしょんのご経験からでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1037-7 - 2012/10/20 (土) 07:57:18 - 難しいコンストラクト作成 みなさん、ありがとうございます。 >普通はすると思いますが、省略することも珍しくないかも。 私は、ミニプレップのプラスミドについては形質転換後の抗生物質なし培養をやりません。コロニーはよく出てきます。このノリで、簡単なコンストラクトについてももやりません。これが難しいコンストラクト作成だと駄目なのです。 QuikChangeでいくつも一度に変異できるMultiというのがありますが、結果は、２時間でも、さまざまな組み合わせが出てきており、意外に同クローンが取れないという経験があります。 >比較対象が何かがわかりませんが、抗生物質の種類はそろえた話なのですよね。 >アンピシリンのように菌を殺さないものと、 アンピシリンは菌を殺すのだとおもいます。（bactericidal　vs bacteriostatic）基本的に、抗生物質の種類は関係ない気がしています。 ＞やっぱりadaptationをきちんとした方が効率いいよねということでしょうか？　2時間は長いと思いますが、もう増殖が始まってますでしょうか、まだlag期でしょうか。 まったく、そういう意味です。目視では増殖が始まっている感じです。 ＞理由は、耐性遺伝子が転写翻訳されて細胞が薬剤耐性を獲得するまでの猶予期間 ですよね？ そうだとすると、簡単なコンストラクトであまり、抗生物質なし培養が必要ないというところが説明できないのです。まったく定量的でないので、すみませんが。

(無題) 削除/引用 No.1037-6 - 2012/10/20 (土) 05:13:00 - おお >[Re:5] Rさんは書きました : > 最近はアンピシリンなんかだとadaptationしないことが多くなったけど、 > やっぱりadaptationをきちんとした方が効率いいよねということでしょうか？ ああ、そう考えるとそうですねぇ。。。 > > >2時間はながいですよね。30クローンぐらいがシングルクローン由来の大腸菌だったりするわけですよね。。。 > > 2時間は長いと思いますが、もう増殖が始まってますでしょうか、まだlag期でしょうか。 ラグはどれくらいかはっきり分からないですが、、、最小バイチにうえ変えて1時間ぐらいとか、増殖期のものを同じバイチに希釈して10分程度とか、、、ストレスがかかるとラグは長くなりますので、、、 30はちょっと多く見積もり過ぎたかもしれません。。。

(無題) 削除/引用 No.1037-5 - 2012/10/19 (金) 11:18:38 - R 最近はアンピシリンなんかだとadaptationしないことが多くなったけど、 やっぱりadaptationをきちんとした方が効率いいよねということでしょうか？ >2時間はながいですよね。30クローンぐらいがシングルクローン由来の大腸菌だったりするわけですよね。。。 2時間は長いと思いますが、もう増殖が始まってますでしょうか、まだlag期でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1037-4 - 2012/10/19 (金) 10:35:38 - ンンノ 理由は、耐性遺伝子が転写翻訳されて細胞が薬剤耐性を獲得するまでの猶予期間 ですよね？普通はすると思いますが、省略することも珍しくないかも。 私も2時間は長いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1037-3 - 2012/10/19 (金) 10:07:55 - ~ 比較対象が何かがわかりませんが、抗生物質の種類はそろえた話なのですよね。 アンピシリンのように菌を殺さないものと、 タンパク質合成を止めて薬剤耐性遺伝子の発現を止めるものでは話が変わってくると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1037-2 - 2012/10/19 (金) 02:19:24 - おお 普通形質転換後にこうせい物質フリーのバイチでインキュベーションするとおもいますが、、、 2時間はながいですよね。30クローンぐらいがシングルクローン由来の大腸菌だったりするわけですよね。。。 またちょっと考えて戻ってくるかもです。

形質転換後の抗生物質なしの培地での培養 削除/引用 No.1037-1 - 2012/10/18 (木) 19:57:47 - 難しいコンストラクト作成 最近、プラスミドの難しいコンストラクト作成では形質転換後の抗生物質なしの培地での１−２時間の培養が割りと有効ということを感じています。 プラスミドの難しいコンストラクト作成とは、たとえばインサートが8000bpとかになる場合です。同意される方、いらっしゃいますか？　また、理由はなんなのでしょう？　ライゲーションはうまくいっているのはゲルでたまに確認しています。

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