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(無題) 削除/引用 No.10369-6 - 2022/03/31 (木) 04:21:37 - おお 再酸化を防ぐためにBisulfiteをRunning bufferに加えるというやり方もあるみたいですね。再酸化が問題になるのはタンパクによるのかもしれません。特に細胞外にあるものはS-S結合が豊富な印象がありますし。

(無題) 削除/引用 No.10369-5 - 2022/03/30 (水) 16:17:11 - h > 4. 電気泳動試料中の還元剤がダメに 横レス失礼。初めて知りました。タンパク分解されているのだと思って捨ててました・・・orz

(無題) 削除/引用 No.10369-4 - 2022/03/29 (火) 20:04:41 - ち 1. 試料に長いDNAが混じっているのかもしれない。よく見ると糸引いてませんか。 →軽く超音波処理あるいは極細の注射針のついたシリンジで数回出し入れしてDNAを剪断する。粘性がなくなればOK. 2. 植物材料だと多糖とかの非タンパク質性の成分など泳動を乱すものがあるかもしれない。 →論文等で同じような試料を分析する際にどうのような前処理をしたか調べる。 3. 非イオン性界面活性剤（Triton X100とかNP-40とか）の持ち込みが多いかもしれない。SDSによる変性を邪魔することがある。 →試料に非イオン性界面活性剤が含まれるならば電気泳動試料中のその最終濃度はSDSの1/10以下にする。 4. 電気泳動試料中の還元剤がダメになってきているのかもしれない。SDS電気泳動試料を−２０℃で長く保存したり、何度も凍結融解したりしていると、還元剤の効力がだんだん低下して、いちど還元されたシステイン残基が再酸化されてランダムな分子間・分子内架橋が生じて、その結果スメアなパタンになることがあります。 →新たにメルカプトエタノールを最終濃度５％になるように追加する。加熱は必ずしもしなくてもいい。

(無題) 削除/引用 No.10369-3 - 2022/03/29 (火) 17:08:59 - G25 どういうふうにスメアしているのか描写したほうがいいんじゃないか。 後ろに引っ張るのか、前に流れるのか、全体にボケてるのか、、、、

(無題) 削除/引用 No.10369-2 - 2022/03/29 (火) 00:59:18 - おお 検出は何ですか。CBBなどのTotalに染めたものですか？あるいは抗体を使ってスペシフィックなタンパクを検出したのでしょうか？ 前者ならいろいろ原因が考えられますが、、、 ゲルの出来がパーフェクトでない 泳動バッファーなどが何らかの原因で適切でない（ゲルのバッファーもその可能性はあるのかも） サンプルの塩濃度が高い。 その他バッファーや夾雑物、バッファー成分によるもの。 上記で前者２つならマーカーもきれいに流れてないでしょうけど、きれいに流れたときのマーカーのイメージがないとなんとも言えないかもしれない。 確認できるところを確認してうまくいかないなら、Tris glycine Buffer systemならLower gelのバッファー濃度を少し高めにしてみてください確か３７５mMTris-HCl （pH８。８）だったと思いますが５００mMとかでしょうか。低分子領域なら倍程度上げてもいいかもしれません。ただし少しレーンの幅が広いところ狭いところが出てくる傾向が多くすればするほど出てきます。グリセロールを５から１０％入れるのも分解能を上げるのに寄与すると思っています。 特定のタンパクを見ているのなら（WBとか）、そのタンパクの特徴かもしれません。Cell lysateとかならアクチンなどのInternal controlできれいなバンドが検出できるでしょうか。 タンパクの特徴としては、泳動距離に影響するリン酸化部位が複数あるとか、バリアントが複数存在するとか、その両者のコンビネーションだったり、その他Modification、Truncationされたものが混在するとか、また糖蛋白はよくちょっとテーリングするような感じでスメアになったりすることもあります。

ウエスタンのバンドがスメアになる 削除/引用 No.10369-1 - 2022/03/28 (月) 20:45:51 - 研究素人 サンプルのアプライ量が多いからスメアになるのではないかと思い、アプライ量をかなり減らして見たのですが、改善されませんでした。 その他の原因がございましたら、ご教授をお願いしたいです。

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