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(無題) 削除/引用 No.10360-3 - 2022/03/24 (木) 04:19:40 - おお まあ理想的にはNTは立ち上がらないわけですが、PCR中にいろいろ副反応が起こるでしょうから何がしかのものが増えてもおかしくはありません。コロナの場合はネガティブコントロールは取っていると思うのでその上で検出されたと言う判断をするものと思います。 理想的条件（増幅効率が１サイクルで２倍とか）でエチブロの検出力で昔計算したことがありますが３５サイクルで１コピー検出できるという感じでした。ですので35付近で立ち上がるのはもしほんとに１コピーの検出を考えているのなら別ですが、そうでない限り検出限界に入っていると考えてもいいでしょう。上記計算はエチブロでの結果で実際はたいていもう少し感度の高い色素を使っていると思いますので若干早いところで検出限界を迎える可能性はあります。 一つ確認しておくべきことは、スペシフィックなアンプリコンが増えているか、関係ないものが増えてきているかです。前者ならコンタミが考えられますので、特に立ち上がるサイクルが毎回変動するようでしたらそのうちコンタミで訳がわからなくなる可能性も考えて対策などを施しながら実験する事をおすすめします。

(無題) 削除/引用 No.10360-2 - 2022/03/24 (木) 02:58:46 - iiii 2) で、他の実験ウェルと比較してあまりにも立ち上がりが遅かったら無視します。

RT-qPCRにおけるノンテンプレートコントロール 削除/引用 No.10360-1 - 2022/03/24 (木) 02:54:47 - タントピーシーアール リアルタイムqPCRにおいて、DNA無しのnon-template control(NTC)を準備する方は多いと思います（多分教科書的にも準備しろとあると思います）。このNTCのウェルでも検出されてしまった場合、但しCtはかなり大きい数字なので量は非常に少量と考えられる場合、皆様どうされてますか？ 私は過去あまりRT-ｑPCRをしてこなかったのですが、最近必要に迫られてかなり多くのサンプルをテクニシャンの方と一緒にやり始めました。十分な経験と技術のあるテクニシャンの方なのですが、たまにNTCでCt=32とか34の値が現れます。どうしたものかと同僚や別ラボの人に聞いてみたら、多くの人が、同じようにNTCでも数字が出ることがある、でも35付近なら無視してそのまま進める、とのことでした。Ct=32なら無視で当然、という人もいました。 1）NTCで検出されたのならば、全ウェル信用できないから結果は破棄してやり直し。NTCでの検出が無くなるまでやり直す。 2）NTCでのCt値による。Ct値が29程度ならやり直すが、35付近で極々少量しかないと思われるなら、無視する。 3）そもそもNTCのウェルを準備しない。意味ないと思うから 35付近なら私も「無視できる位小さいかも」と思うのですが、そういえば新型コロナのPCRでの検出はCt=40とかCt=45とかの時があったとかなかったとかいう話もあったような気がします。どうしたものか、皆様のご意見をお聞かせ下さい。よろしくお願いします。

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