Bio Technical フォーラム

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(無題) 削除/引用
No.10360-24 - 2022/03/31 (木) 07:59:35 - スンナ派
>[Re:21] おおさんは書きました :
> >[Re:17] スンナ派さんは書きました :
> > PCRよりfalse positiveが少ないからスクリーニングに使われている検査法がELISA法、IC法、CLIA法って、それって単に感度が低いけど簡便だってだけでは?
>
> https://www.cdc.gov/hiv/pdf/testing/hiv-tests-laboratory-use.pdf
>
>

これがPCRより高感度だってことを示す資料なんですか?

(無題) 削除/引用
No.10360-23 - 2022/03/31 (木) 07:58:07 - スンナ派
>[Re:22] おおさんは書きました :
> ちなみにCovidのPCR検査の検出力はプラクティカルに70%です。10人のうち3人はFales negativeになってしまいます。

他の低感度の検査ならさらに悪くなるだけでは?

(無題) 削除/引用
No.10360-22 - 2022/03/31 (木) 07:53:21 - おお
ちなみにCovidのPCR検査の検出力はプラクティカルに70%です。10人のうち3人はFales negativeになってしまいます。

(無題) 削除/引用
No.10360-21 - 2022/03/31 (木) 07:50:40 - おお
>[Re:17] スンナ派さんは書きました :
> PCRよりfalse positiveが少ないからスクリーニングに使われている検査法がELISA法、IC法、CLIA法って、それって単に感度が低いけど簡便だってだけでは?

https://www.cdc.gov/hiv/pdf/testing/hiv-tests-laboratory-use.pdf

(無題) 削除/引用
No.10360-20 - 2022/03/31 (木) 07:47:40 - スンナ派
上海では2500万人に対してPCRでスクリーニングしていますよ。

(無題) 削除/引用
No.10360-19 - 2022/03/31 (木) 07:44:14 - スンナ派
HIVは空気感染(エアロゾルでも結構ですが)もしないし進行も遅いからコロナ対策と比較することが適当だとは思えません。

(無題) 削除/引用
No.10360-18 - 2022/03/31 (木) 07:40:44 - スンナ派
本来のtempleteが増えてしまっているfalse positiveならばそれは試料間のコンタミが原因であって、それならば検出原理がなんであれ高感度になれば同じことが起こるはずだと思うんですけど。

(無題) 削除/引用
No.10360-17 - 2022/03/31 (木) 07:31:31 - スンナ派
PCRよりfalse positiveが少ないからスクリーニングに使われている検査法がELISA法、IC法、CLIA法って、それって単に感度が低いけど簡便だってだけでは?

(無題) 削除/引用
No.10360-16 - 2022/03/31 (木) 02:53:52 - おお
https://www.aids-chushi.or.jp/ippan/hiv/

たとえばHIVでもPCRはスクリーニング検査には使いませんが、検査の手法として実際に使われます。スクリーニング検査はFalse positiveは極力低いものを選ぶようにされておりPCRはその性質上不向きです。

(無題) 削除/引用
No.10360-15 - 2022/03/31 (木) 01:08:01 - おお
>ですから、この検査は従来スクリーニングに使うべきでないと申しております。

などとコメントされなきゃならないのか理解できません。

この診断方法はコロナらしい症状を持つ人に対して確定診断として使われるものという認識で(いろいろな医療関係者がそう言っている)その上で問題はないと申しております。

しかしながらこれを一時スクリーニングに使っているということに問題がある。すなわち従来スクリーニングに使うと問題があるという指摘には同意しているということです。これもPCRを誰でもできるようにしようという流れでいろいろな医療関係者が問題だと言っていたわけです。

ですから用途で評価が異なります。

(無題) 削除/引用
No.10360-14 - 2022/03/30 (水) 11:08:35 - タントピーシーアール
>ですから、この検査は従来スクリーニングに使うべきでないと申しております
そう思っておられたのだったら、最初からその旨きちんと明示しておいて欲しかったです。というか、そうは思ってなかったとしか理解できないおおさんの書き込みでした。

1)私がこのPCRには問題がありそうですねと書き込む
2)おおさんからコメント「ノンスペを出さないような厳しい条件にして増幅効率を下げているのなら問題はない」「問題があるかどうかはその系を立ち上げたときのデーターを見てからおっしゃってください」
3)私から「実際にみてみました。やっぱり問題あると思います」
4)おおさんから、私が指摘した問題点に対して問題を擁護する書き込み。「実際のデーターで38サイクルでポジティブだった方が軽症の風邪様症状を持っていて(もしかしたら無症状だったかもしれない)、その後典型的な症状になってウイルス量も増えたという報告を論文で見たことがあります。」の書き込みもあり。

なんでこの流れで
>ですから、この検査は従来スクリーニングに使うべきでないと申しております。

などとコメントされなきゃならないのか理解できません。ですから、って何でよ?2)の「問題はない」の書き込みをされたのおおさんですよ。後で「書き過ぎました」とは書いてますが、「過ぎました」と言われても普通は元の意見が真逆になる程だったなんて思いませんよ。

>でお示しの論文ではFalse positiveはTrue negative 112件に対してたった一つになってますよ。またもう少しプラクティカルなデーターでは、5%以下とされています。

これを読んで、書き手が「5%は多すぎて問題あるな」と思っているという理解をする読者がいたら単なる馬鹿でしょう。「たった一つ」、そして続いての「また」は前の文章をうけての接続詞で、前の文章と同じ趣旨のことを言う為の「また」でしょう、これ。だから書き手の言いたいことは「たった5%」しか無いだな、と理解するのは極々普通のことです。

なんでこれで

>なので5%のFales posi で今の使い方では問題があるというのは前述の通り意見は一致していますいっぱい書きすぎたので把握しきれなかったのかもしれませんが。

などと言われなきゃならないのか理解に苦しみます。一致なんかしてません。私は5%「も」ある、おおさんは5%「しか」ない、です。書いてないことは把握なんて出来ませんよ。

アドバイスを頂けるのはありがたいですが、流石に支離滅裂に過ぎます。

(無題) 削除/引用
No.10360-13 - 2022/03/30 (水) 10:12:38 - おお
>[Re:12] タントピーシーアールさんは書きました :

> その上で書きますが、私はこのPCRのプロトコール自体にはやはり問題があると思います(というかPCR自体がそういうものと言えるかもしれませんが)。繰り返しになりますが、コンタミなりなんなりでfalse positiveとなってしまうサンプルが大量に出過ぎるからです。1%や5%というのは基礎研究者の目から見ると小さく感じるかもしれませんが、決して小さな数ではありません。プラクティカルに5%弱出るとすれば、10万人中の5000人弱です。昨年の1月〜3月位の間のPCRの一日の検査数は3〜20万位のようです。5%弱、無視出来る程に小さいでしょうか?また、一回の検査で確定する訳では無く時間を置いてから再検査するのだからと仰いますが、その間仕事にも行けなくなるわけで、これが理由で経済的にかなりの打撃を被る人もいて不思議無いですよね。

ですから、この検査は従来スクリーニングに使うべきでないと申しております。初期の検査のデザインは症状がある人、濃厚接触者に施すというのが前提でした。今や希望すると受けれるようになったり、何ら症状もないのに検査して陰性であることを確認しろとかいう話になっているから仰る問題が出てきているのです。なので5%のFales posi で今の使い方では問題があるというのは前述の通り意見は一致していますいっぱい書きすぎたので把握しきれなかったのかもしれませんが。

>おおさまが仰るような「ノンスペを出さないような厳しい条件にして増幅効率を下げている」といったデザインには見えません。また、私がリンクを出した論文で増幅効率が100%で無い「ようだ」と仰いますが、仮にそうだとしても、それは狙ってやったものではないでしょう。
>> ノンスペを出さないような厳しい条件にして増幅効率を下げているのなら問題はないです。

>これは、事実そのようなプロトコールにしているということですか?それとも、そのようにしているはずだから問題ないはずという仮定の話ですか?

ですからそそこについては書きすぎましたと申し上げました。効率よりも優先したいものがあるという話です。

(無題) 削除/引用
No.10360-12 - 2022/03/30 (水) 09:45:40 - タントピーシーアール
PCRのプロトコールに問題があるのと、「検出方法に問題があっても、危険なウイルス故にfalse positiveが多少出ても目をつぶることにする」というのは別の話でしょう。危険なウイルスの検出なのでPCRの問題そのものが無くなります、という訳では無いのだから。

その上で書きますが、私はこのPCRのプロトコール自体にはやはり問題があると思います(というかPCR自体がそういうものと言えるかもしれませんが)。繰り返しになりますが、コンタミなりなんなりでfalse positiveとなってしまうサンプルが大量に出過ぎるからです。1%や5%というのは基礎研究者の目から見ると小さく感じるかもしれませんが、決して小さな数ではありません。プラクティカルに5%弱出るとすれば、10万人中の5000人弱です。昨年の1月〜3月位の間のPCRの一日の検査数は3〜20万位のようです。5%弱、無視出来る程に小さいでしょうか?また、一回の検査で確定する訳では無く時間を置いてから再検査するのだからと仰いますが、その間仕事にも行けなくなるわけで、これが理由で経済的にかなりの打撃を被る人もいて不思議無いですよね。

>また、検出系のデザインにあたってPCRで検出できるから回せるだけ回して検出すればいいと考えて系を組むようであればそれは診断方法として承認されません。
勿論その通りであって欲しいとは思います。しかし、承認されたプロトコールにおける検出系のデザインは本当に良いものと言えるでしょうか?少なくとも、おおさまが仰るような「ノンスペを出さないような厳しい条件にして増幅効率を下げている」といったデザインには見えません。また、私がリンクを出した論文で増幅効率が100%で無い「ようだ」と仰いますが、仮にそうだとしても、それは狙ってやったものではないでしょう。Fig.1Bにあるのは(ある程度のコピーナンバーを元にしたデータで)直線性を主張するものです(というか、この増幅効率の話、言ってるおおさん自身は本当に信じてますか?)。

以前にお聞きした

>> ノンスペを出さないような厳しい条件にして増幅効率を下げているのなら問題はないです。

>これは、事実そのようなプロトコールにしているということですか?それとも、そのようにしているはずだから問題ないはずという仮定の話ですか?

にお答え頂けますか?

(無題) 削除/引用
No.10360-10 - 2022/03/29 (火) 08:04:24 - おお
あと、PCRの効率を犠牲にしてバックグランドが出ないのを重視したというコメントを書きました。ついつい書きすぎてしまいましたが、まずプライマーをCt値を使って定量するためには効率が100%でなければいけません。これは同じくらいのTmのプライマーセットでアンプリコンが同じくらいの長さでも、効率はかならず100%ではないのでValidationした配列が使われます。しかしながら検出を優先するなら、効率のValidationよりも検出感度(バックグランドが低いなど)が優先されるはずです。実際にお示しの論文では増幅効率について言及してないように思います。また、10^8から6。6x10^3 per mlで20から38サイクルの幅を持っているように思われますから(グラフから)、効率が100%でないように見えます。

もちろんそれでも40サイクルも回して意味があるかという話はあります。それは検出があやふやになるからというよりは、ウイルスを持っていても感染させるほどの量出ないのがどれくらいかなど情報が蓄積してきたからです。

(無題) 削除/引用
No.10360-9 - 2022/03/29 (火) 07:59:26 - おお
まず一つ、この病気をPCRで検出するにあたってバックグランドを知る必要があると思います。
このウイルスが発生した直後、非常に毒性の強い未知のものでした。感染疑いがある人はその人の協力のもと(国によっては強制的に)隔離する必要があるという判断はであったと思います。検出された検体に関しては(1コピーあるいは検出限界以上)、その人がウイルスを持っているとして扱う必要があったわけです。例えば採取したサンプル、50ulに25コピーあったとして5ulをPCRに回すなら、チューブに2コピー強になります。これだけ少ない量になりますと5ul取ったとき、たまたま0コピーだったということもありえるので、2つのうち1つでもポジティブなら陽性としている理由です。また、当時ウイルスは肺で増えて障害を起こすものだから、鼻から検体を取ってきても病状があってもそんなにウイルスが取れていない可能性があるとも言われていました。当時は風邪様症状があれば検査する、あるいは濃厚接触者も加えるという事である程度診断としては理にかなっているものでしたが、今は希望者は誰でもというふうに(一部の科学的ではない声などの圧力などで)なってしまっていて、数字だけが増えつつ独り歩きしてしまってはいます。

実際のデーターで38サイクルでポジティブだった方が軽症の風邪様症状を持っていて(もしかしたら無症状だったかもしれない)、その後典型的な症状になってウイルス量も増えたという報告を論文で見たことがあります。

でお示しの論文ではFalse positiveはTrue negative 112件に対してたった一つになってますよ。またもう少しプラクティカルなデーターでは、5%以下とされています。
https://www.fda.gov/media/134920/download

加えて徐々にツールも開発されてきて、サンプルをカセットに入れたらそのままカセット内で検出できるようなものがOn site用として開発されてもいます。


また、一度ポジになったひとは数日後テストするという事により経過を見ることで感染しているかどうかを判断することになるので、一回だけで保菌者とするわけでもないです。

また、検出に当たる検査技師は1コピーを検出するようなPCRを行うことを前提に訓練を受けた人です。だからPCR検査のキャパが初期に増やせなかった理由です。PCRができる研究者などたくさんいても任せられないという現状があったわけです(他にも感染源を扱うわけですからそういう意味でもハードルはあったと思いますが)。また、検出系のデザインにあたってPCRで検出できるから回せるだけ回して検出すればいいと考えて系を組むようであればそれは診断方法として承認されません。

(無題) 削除/引用
No.10360-8 - 2022/03/25 (金) 12:29:15 - タントピーシーアール
自己レスです

>コピー数と、それに対する増幅曲線の例が載ってるような資料を探したのですが、そういう分かり易いデータを見つけられませんでした。データをお持ちでしたら教えて頂けますか? 

ttps://www.takarabio.com/applications/pathogen-detection/sars-cov-2


実際の患者の検体を使っての増幅曲線の図もありました。例えば以下。

ttps://journals.plos.org/plosone/article/file?type=printable&id=10.1371/journal.pone.0236564

ウイルス量の多い検体だとCt22-23程度から立ち上がる。こういうサンプルもあるなかでクロスコンタミが起こったら、Ct35以降で立ち上がるようなウェルが散見されても不思議無いですね。そういうのものもポジティブとしてカウントするのはやっぱり問題あるかなと思いました。NTCであってもCt32以降程度での立ち上がりなんてよくあること、と考える人が周りに多いという事実を知ったのでそう思う次第です。

(無題) 削除/引用
No.10360-7 - 2022/03/25 (金) 11:54:09 - タントピーシーアール
おお様、引き続きありがとうございます。

> ノンスペを出さないような厳しい条件にして増幅効率を下げているのなら問題はないです。

これは、事実そのようなプロトコールにしているということですか?それとも、そのようにしているはずだから問題ないはずという仮定の話ですか?

>それに系を立ち上げるときにコピー数を振って実際にどのように系が働くか見ているはずですから。

コピー数と、それに対する増幅曲線の例が載ってるような資料を探したのですが、そういう分かり易いデータを見つけられませんでした。データをお持ちでしたら教えて頂けますか? 

コロナ陽性者を見つけ出す為にウイルスの検出を目的とすると増幅効率は高い方が良いと思いますが、しかしノンスぺを出さないような条件とするためには増幅効率を下げた方が良い、となると案外に難しい条件な気がしますね。

ttps://www.niid.go.jp/niid/images/lab-manual/2019-nCoV20200217.pdf

ネットで見つけた国立感染症研究所が配布したプロトコールの情報です。ここの
>4.3. リアルタイム one-step RT-PCR(TaqMan プローブ法)反応
を読んでみました。増幅効率を下げる為にPCR産物をわざと大きくしている、などあるか調べてみました。PCR産物の大きさは150bp以下なので教科書的にごく標準の大きさといえるかと思います。PCRのプロトコールでアニーリングの温度を凄く高くしているとかあるかと思いましたが、そういったこともないです。RT-qPCRにしてはプライマーの濃度が少し高い(800nM)のじゃなかろうかと思いましたが、通常の5倍とか極端に高い訳では無いと思います。確か教科書的には500nM位までが推奨されてると思います。昔使っていたgenotypingでの(普通の)PCRでは800nMでのプロトコールを使っていましたし、そうおかしな濃度ではないのだろうという気もします。この点、もし経験のある方おられましたら教えて下さい。取りあえず、私にはPCRそのもので「増幅効率を下げている」ようには思えませんでした。

>サンプリングの仕方も臨床なので理想的にはなく妥協もあるはずですから
仰る通りと思います。この経験のある方の書き込みがあったら嬉しいのですが。

>問題があるかどうかはその系を立ち上げたときのデーターを見てからおっしゃってください。

データは見ていませんが、プロトコールそのものを見ると、なんか色々問題がありそう。

>陽性コントロールの増幅曲線の立ち上りが40サイクル以内にみられ、かつ陰性コントロールの増幅曲線の立ち上がりが見られないときに試験が成立するとみなす

とあって、やはりカットオフ値はCt40でした。最初にネガコンのウェルを用意するようにとありますから、ネガコンで立ち上がらないことがサンプル間でのコンタミが無いことを証明するわけでもないですね。Ct40近く、いや仮に35程度で立ち上がった場合でも、それが発現の高いところとのクロスコンタミの結果だったとしても判別する術はなさそうな気がします。

ついでに、
>検体において、N2セット2つのウェルのうち、一方あるいは両方で反応時間内に増幅曲線の立ちあがりが見られた場合に陽性とみなす。

とあって、片方でも陽性扱いなのか再検査じゃないのか、という気がしました。私は問題のあるプロトコールだな、と思います(もちろん、費用の面からとか色々あって妥協してる面もあるんでしょうが)。実際にやっている方の経験談など聞けると良いのですが。

(無題) 削除/引用
No.10360-6 - 2022/03/25 (金) 09:48:15 - おお
>[Re:5] タントピーシーアールさんは書きました :
> 皆様、参考になるレスありがとうございます。

> >おお様
> もし(検出力が弱いとみなせる)エチブロでの検出においても35サイクル回せば1コピーを検出可能であるならば、最近のもっと検出力の高いシステムでの35回とか40回(45回?)をカットオフ値とみなすPCRでの新型コロナ検出は、なんか問題ありそうですね。

ノンスペを出さないような厳しい条件にして増幅効率を下げているのなら問題はないです。それに系を立ち上げるときにコピー数を振って実際にどのように系が働くか見ているはずですから。加えてqRTーPCRなのでDNAの1コピーのようにはいかないでしょうし、サンプリングの仕方も臨床なので理想的にはなく妥協もあるはずですから。問題があるかどうかはその系を立ち上げたときのデーターを見てからおっしゃってください。

(無題) 削除/引用
No.10360-5 - 2022/03/25 (金) 07:00:47 - タントピーシーアール
皆様、参考になるレスありがとうございます。

>iiii様
現実的にはこれですよね。聞いてみたら、周りの人も同じようにしてる人が殆ど(というか全員)でした。サンプルのCt値が23、NTCが32だったとして発現量は2の9乗で512倍違うわけだから、グラフにしたらほぼ見えなくなるレベルな訳だし、私もこれで問題無いと思います。


>おお様
もし(検出力が弱いとみなせる)エチブロでの検出においても35サイクル回せば1コピーを検出可能であるならば、最近のもっと検出力の高いシステムでの35回とか40回(45回?)をカットオフ値とみなすPCRでの新型コロナ検出は、なんか問題ありそうですね。30以下で検出できるようなはっきりしてる場合は問題無いのでしょうが。今は実際のところCt値いくつをカットオフ値にしているんでしょうね?

今回、周りの人に聞いてみたら、NTCでCt値が35近辺で出るのは日常茶飯事という人も結構いて、案外と「ネガコンはほぼゼロです」って人はほとんどいなかったです。この点、もっと多くの人からの話をお聞きしたいです。


>おお様、あの様
melt curve確認しております。目的遺伝子の場合が殆どで、プライマーダイマーと思われるピークにはまだお目にかかったことがありません(オーソドックスな普通のPCRからのアガロースゲル電気泳動だとプライマーダイマーが確認されるプライマーセットでも、RT-qPCRでやるとプライマーダイマーがみられないことが数回ありました。一度、melt curve確認ステップを省略して、サンプルをアガロースゲル電気泳動にかけたことがありますが、やっぱりプライマーダイマーのバンドは見られませんでした)。つまりはどこかで(おそらくサンプルからだと思います)コンタミしてるということですよね。

普通のPCRでの話ですが、昔の同僚がコンタミ由来と考えられる意図しないバンドをよく生成していたのが、PCRの際にはフィルターチップを使うようにしたら劇的に改善したことがあります。同様の方法を取りたいのですが、今、フィルターチップが全然手に入らないんですよね……。もう一つ、指でエッペンチューブを開けていたのをチューブオープナー(プラスチックで出来た小さい栓抜きのような形のもの)で開けるように指導したら改善した、というのもあったので、取りあえずこれを実行します。


>あの様
>NTCのウェル位置は、利き手と反対側の上側にして(右利きならA1)、
早めに蓋をする。
仰ることは分かるのですが、これだとNTCのウェルでの値をゼロにすること自体が目的になってしまっていて、NTCを準備する本来の目的(コンタミがないかどうか調べる)から外れてしまってるような気がします。もっとも、Ct値32だから無視して良いや〜、なんてのも全然目的から外れてる訳ですが……。昔はバイオ初心者のバイブルだったバイオ実験イラストレイテッド(もしかして若い人は知らないのかな?)では、サンプルを全部準備した後にネガコン、ポジコンの順で準備すると良いとありました。


引き続き、書き込みよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用
No.10360-4 - 2022/03/24 (木) 19:46:04 - あの
念のためですが、melt curveは確認していますか?

Primer dimerなら、後で増えてくる可能性があります。

そうで無いなら、手技を見直す。

たとえば、NTCのウェル位置は、利き手と反対側の上側にして(右利きならA1)、
早めに蓋をする。

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