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(無題) 削除/引用 No.10360-44 - 2022/04/05 (火) 02:30:12 - BBB cDNAではないがサンプルを入れているいう意味ですよね。 波形を確認してみてください。 Ct値は波形から算出されているものであり、生理学的な意味やコンタミとは無関係に、CTが３０から４０で数値が計算されることがあります。 一方で、完全にブランクにしたWellでCT値が算出されていたら試薬が飛び散っています。

(無題) 削除/引用 No.10360-43 - 2022/04/05 (火) 01:26:25 - おお くわえて、高感度の検出が必要ないならサイクルを３２、３で止めてもいいのではないかと思います。またCycle thresholdの値はデフォルトで１０SDぐらいになっているとおもいますが、これを上げると感度が落ちますが精度が上がります（もちろん飽和しそうなところまで上げると精度もだめになりますけど）。逆に下げると感度が上がりますが精度は下がります。 であるならば、今までの経験上NTCの立ち上りを見ながらCycle threshold値を決めればいいのではないかと思います。マシーンがオートに決めてくれているのでほとんど気にしない人も多いでしょうけど、感度と精度をきめる重要なパラメーターでありますので自身の実験に合わせた最適な値を再考してみてもいいのかもしれません。マシーンが独自のアルゴリズムを使ってCycle threshold値をきめているならちょっとやりづらいかもしれませんが。 この辺はみなさんどうしているかも気になるところです。

(無題) 削除/引用 No.10360-42 - 2022/04/05 (火) 01:11:58 - おお 診断のことはこのレスにおいてはおいておきます。 もし誰も言及していないならと思いますので、ちょっとした手順の工夫を書いておきます。診断の手順を書いたものにも書かれていたように記憶してますが、まずポジコンはすべてのサンプルをアプライして蓋を閉じてからWellに入れる。これによりサンプルやNTCへのポジコンのコンタミが極力防げます。 このことからまずNTCを先に入れて蓋をしてから、サンプルを入れるならNTCにサンプルなどからのコンタミが防げるはずです。試薬調整もまずサンプルは出さずに（あるいは別のbucketにおいておくなど物理的に分けておいて）、Master mixとNTCをつくり、酵素やバッファーのチューブはしまってしまう（サンプルとかの接触極力さけるため）。そのうえでNTCをWellに入れていき蓋をして、ここでサンプルをMaster mixと混合してWellにいれる。同様に蓋をしたあとポジコンへと進む。 いまは蓋をする代わりにシールすることも多いのかもしれません。うまく切り分けで部分部分シールできるのかはわかりませんけど。何れにせよNTCを物理的に遮断した上でサンプルを入れるなど工夫することでコンタミは防げるはずです。またサンプル、NTC、ポジコンの間でのコンタミが否定できれば、環境や試薬などを疑う根拠とにもなりますので、対処をどのようにするのかも決めれるのではないでしょうか。 もし実行済みなら無視してください。

(無題) 削除/引用 No.10360-41 - 2022/04/01 (金) 08:13:02 - タントピーシーアール iiiiさん再びありがとうございます。 私も基礎研究組です。NTCに関して私と似たような結果が出ていた方がいたという情報は大変ありがたいです。私も、出ないことの方が多いのですが、たまに >NTCもかなり遅くですがカーブができていた という状態です。結果、Ct値が37とか38とかとなります。私にはこのCt値37とか38が意味のある数字とは思えないのですが、コロナの診断ではカットオフ値がCt=40で、これら37とか38が意味のある数字、すなわち患者が新型コロナ陽性者と判断されるというので、それって問題のある検出手段なのでは？と思った次第です。false positiveが5%弱もあるという話をおおさんに教えて頂き、やっぱり問題あるんだな、と思いました。 >臨床でも患者様の様子や他の検査も合わせて総合的に判断されますよね。 このあたり、PCRでの検出も含めて実際の経験のある方のお話が聞けたらよいのですが、そううまくいかないですね（守秘義務とかもあるのかも？）。Ct値40近くで出た場合の対処方法が実地の場面ではどうなっているのか、とか情報があったら良いのですが。立ち上がった後シャープな増幅曲線を描く場合もあれば、これ位で出てくる奴だと（どう表現したらよいかちょっとわかりませんが）線がヨレヨレの場合もあるし。 >エンドユーザーですしqPCRもあくまでいくつか行う実験の一つのアッセイの結果ですのでそこまではみなかったです。 大変参考になります。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10360-40 - 2022/04/01 (金) 07:42:37 - タントピーシーアール 88様、引き続きありがとうございます。 > 言ってしまうと生データを提示したときにネガコン出てるよねってなるのがいやなだけです 物凄くよくわかります。 > こっちは経験則で無視しても大丈夫ってなってても、じゃあ絶対影響がないのかっていわれると面倒なので これは、経験則というか、無視しても大丈夫なくらい影響が小さいのがわかっているから、ということですよね？つまり、単純に見ている遺伝子のCt値に比べてNTCでのCt値がかなり大きいからということだと理解しているのですが、これであってますか？ 理屈上は、仮に毎回遅めのサイクルでノンスぺバンドが生成されたとしても、見ている遺伝子の発現に関して使っているサンプルのCt値の範囲できちんと（二倍量のtemplateを使えばCtが1減る、といった）直線性が保たれているのであれば、遺伝子の発現量を比較する系としては成立するということになると思います。でも、もしそんなケースだったとしたら説明はちょっと面倒くさそう。NTC抜きにして、段階希釈したテンプレートでのCt値を出して説明すれば良いのかな。 > 毎回でもないコンタミ疑いだったら余計にやり直したほうがいいかなと思いますがきれいなデータとネガコン出てるデータと比較するなり一緒にするなりして使ってるんですよね？ > 毎回独立してて他と関係ないならいいんですが > 今のところは比較するサンプル全てが96ウェル一枚に収まっているので大丈夫です。しかし、今後はref. geneの発現を元に複数枚での結果を比較する機会もあると思います。私はこの場合でもNTCでのCt値が十分に大きい（見たい遺伝子でのCt値がだいたい25程度、NTCで36とか）なら無視しても良いだろうと思っているのですが、これ問題あるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10360-39 - 2022/04/01 (金) 05:19:47 - iiii 臨床での診断のために行うのか基礎研で行うのかにもよるのかもしれませんね。私は基礎研組でNTCと検量線を必ず入れていたので、検量線がきれいにかけるくらいにカーブが立ち上がり、NTCは立ち上がらないあるいはかなり立ち上がりが遅い、と判断できたらよしとしていました。しばらくやっていないので詳しく覚えておりませんが、しばしばNTCもかなり遅くですがカーブができていたような。。。（全く立ち上がらない場合ももちろんありました。）どうしてもサンプルを入れる際に微妙にコンタミしてしまうのか、なにかに反応してしまうのは仕方がないのかなと考えていました。実験の目的が「完璧なqPCRをするために気をつけるべき点を探る」だったり試薬関係の会社だったらNTCが反応してしまった理由を探すのかもしれませんが、エンドユーザーですしqPCRもあくまでいくつか行う実験の一つのアッセイの結果ですのでそこまではみなかったです。臨床でも患者様の様子や他の検査も合わせて総合的に判断されますよね。確かにサンプルのクロスコンタミネーションには気をつけます。SYBR GreenではなくTaqMan Probe法を行っていました。

(無題) 削除/引用 No.10360-38 - 2022/03/31 (木) 14:13:48 - 88 > > 治験とか論文用の大事なものはやり直し > > かなり微量（Ctが35付近とかで立ち上がる）の場合でもやり直しですか？もちろん、正しくはそうなんだとわかっているのですが。参考にさせて頂きます。 言ってしまうと生データを提示したときにネガコン出てるよねってなるのがいやなだけです こっちは経験則で無視しても大丈夫ってなってても、じゃあ絶対影響がないのかっていわれると面倒なので 計量線引いて0以下だから無視しましたって言えるならそれまでですが > > 毎回出るならプライマー変えるかエアロゾル疑って作業する部屋をかえるかな > > 参考にさせて頂きます。取りあえず、今のところ毎回出てるわけではなく、単純にサンプルとのクロスコンタミを疑っているのですが、もしも毎回出るような羽目に陥ることがあったら、プライマーを変えるなり部屋を変えるなりを手段として考えます。 毎回でもないコンタミ疑いだったら余計にやり直したほうがいいかなと思いますが きれいなデータとネガコン出てるデータと比較するなり一緒にするなりして使ってるんですよね？ 毎回独立してて他と関係ないならいいんですが

(無題) 削除/引用 No.10360-37 - 2022/03/31 (木) 13:47:04 - タントピーシーアール ＞おおさん もう結構です。カットオフ値をCt=40と定めていれば、Ct=35近辺でクロスコンタミで立ち上がってfalse positiveになってしまうような検体が出てくるので問題あるのでは？という私の主張は終始一貫しています。これはスクリーニングに使われようが確定診断に使われようが問題になることです。 私が上記の「問題がある」と書いているところへ「ノンスペを出さないような厳しい条件にして増幅効率を下げているのなら問題はないです」「「問題があるかどうかはその系を立ち上げたときのデーターを見てからおっしゃってください」と言われた訳です。普通に考えて、私が考える問題（クロスコンタミでfalse positiveになってしまう問題）に対処されたプロトコールになっているんだ、知りもせずに何を言っている、そう言われたと解釈するのはおかしなことではないでしょう。 で、実際に見てみたら、特にそのような条件にしているとも思えないPCRのプロトコールであることがわかっただけの話でした。これで、その後に「問題が無いと言ったのは、確定診断に使われる場合だけだ」とか言われても、何言ってんだ？としか思いません。 「未知の危険なウイルスだからfalse positiveも仕方が無い」と「カットオフ値がCt=40のPCRでの検出はfalse positiveの問題が出てくる」と指摘するのは別に両立しない話ではありません。12で既に書いた通りです。 >No.10360-9にも以下のようにかいて、確定診断からスクリーニングにシフトしてしまっていることを述べていたのですが、 確定診断に使われるなら問題は無いという風に話が進んでいますが、実のところ、別にPCRの問題そのものは残っているだろう、としか思ってません。新型コロナではないが風邪に似た症状が出て検体を提出したという場合に、他のpositive sampleとクロスコンタミして新型コロナと診断されてしまう問題なんてのはどこまでいってもついて回るでしょう（カットオフCt値が今は下がっているというのなら話は別ですが、そういう話はこのトピでは一回も出て来てませんよね）。 >HIVのPCR検査の検出限界は１ml あたり５０とか５００です。コロナより感度いい。どれくらいのCt値で判断しているのでしょうか。 別の話を持ってきて、コロナのPCRのプロトコールの正当性を訴えてる、という理解でよいですか？別物でしょう、としか。HIVではもっと高いCt値をカットオフ値にしているということだとして、私はそれは全然知りませんでしたが、かといって、じゃあ私が考えているコロナ用のPCRの問題は棚上げできるな、などとは全然思いません。それはそれ、新型コロナのPCRはfalse positiveが5%弱も出る問題あるプロトコールには変わりない、と思うだけです。

(無題) 削除/引用 No.10360-36 - 2022/03/31 (木) 10:39:52 - スンナ派 >[Re:33] おおさんは書きました : > >この点では１〜５％ぐらいの > この点では１-５％ぐらいの わかってます。で、Really?と。

(無題) 削除/引用 No.10360-35 - 2022/03/31 (木) 10:17:09 - タントピーシーアール 88さま、レスありがとうございます。 > 微量でコンタミじゃなくて明らかにダイマーなのが分かっててルーチンでかけてるものは無視 納得です。 > 治験とか論文用の大事なものはやり直し かなり微量（Ctが35付近とかで立ち上がる）の場合でもやり直しですか？もちろん、正しくはそうなんだとわかっているのですが。参考にさせて頂きます。 > 毎回出るならプライマー変えるかエアロゾル疑って作業する部屋をかえるかな 参考にさせて頂きます。取りあえず、今のところ毎回出てるわけではなく、単純にサンプルとのクロスコンタミを疑っているのですが、もしも毎回出るような羽目に陥ることがあったら、プライマーを変えるなり部屋を変えるなりを手段として考えます。

(無題) 削除/引用 No.10360-34 - 2022/03/31 (木) 10:07:23 - おお >35付近なら私も「無視できる位小さいかも」と思うのですが、そういえば新型コロナのPCRでの検出はCt=40とかCt=45とかの時があったとかなかったとかいう話もあったような気がします。 ですからこの設定がされた初期から、風邪様の症状や濃厚接触者に限っての検査でスクリーニング目的には使わない設定だったんですよ。その現状からスクリーニングとも限らないだろうと思ったのです。 確定診断はコピー数はそこそこ高いからカットオフを高めに設定できるとおっしゃいますが（いまやコロナではそれが明らかになっていますが）、HIVのPCR検査の検出限界は１ml あたり５０とか５００です。コロナより感度いい。どれくらいのCt値で判断しているのでしょうか。 https://www.nature.com/articles/7290361 No.10360-9にも以下のようにかいて、確定診断からスクリーニングにシフトしてしまっていることを述べていたのですが、説明不足ですいません。 >当時は風邪様症状があれば検査する、あるいは濃厚接触者も加えるという事である程度診断としては理にかなっているものでしたが、

(無題) 削除/引用 No.10360-33 - 2022/03/31 (木) 09:45:07 - おお >この点では１〜５％ぐらいの この点では１-５％ぐらいの

(無題) 削除/引用 No.10360-32 - 2022/03/31 (木) 09:39:47 - 88 そもそもなところで うちではですが、目的によります 微量でコンタミじゃなくて明らかにダイマーなのが分かっててルーチンでかけてるものは無視 治験とか論文用の大事なものはやり直し 毎回出るならプライマー変えるかエアロゾル疑って作業する部屋をかえるかな

(無題) 削除/引用 No.10360-31 - 2022/03/31 (木) 09:24:47 - タントピーシーアール >>スクリーニングとしてのPCRはそれ用にきちんとデザインされてるから大丈夫です、という主張ですよね、これ。 >ちがいます私は最初はあなたがスクリーニング用検査として考えていると思っていませんでした。 私が元々立てたスレ（No.10360-1）に書いたのが >35付近なら私も「無視できる位小さいかも」と思うのですが、そういえば新型コロナのPCRでの検出はCt=40とかCt=45とかの時があったとかなかったとかいう話もあったような気がします。 で、私がNo.10360-5でおおさんへの返信で書いたのが >最近のもっと検出力の高いシステムでの35回とか40回（45回？）をカットオフ値とみなすPCRでの新型コロナ検出は、なんか問題ありそうですね。 さらに私がNo.10360-7で書いたコメントは以下で >コロナ陽性者を見つけ出す為にウイルスの検出を目的とすると増幅効率は高い方が良いと思いますが プロトコール見つけましたとリンクを貼って「カットオフ値はCt40でした」「Ct40近く、いや仮に35程度で立ち上がった場合でも、それが発現の高いところとのクロスコンタミの結果だったとしても判別する術はなさそうな気がします」と書いてます。 更に、No.10360-8で論文のリンクを貼って、出したコメントが以下。 >クロスコンタミが起こったら、Ct35以降で立ち上がるようなウェルが散見されても不思議無いですね。そういうのものもポジティブとしてカウントするのはやっぱり問題あるかなと思いました。 どう考えてもスクリーニングで起こりえる問題についての話しかしてないですね。 一貫してCt=35とかの大きい数字を問題にしているスレ主なんですが、それに対して「スクリーニング用検査として考えていると思っていませんでした」？どういう読解力なのですか？　そもそも、私は確定診断としてのPCRとしての話はおおさんがしてくるまで一回もしていませんよ。Ct=40付近で立ち上がるようなものもポジティブにするのは問題だろうとか、スクリーニングに関しての話としか思えないことしか書いていない。 これで >ちがいます私は最初はあなたがスクリーニング用検査として考えていると思っていませんでした。 って、そんな言葉を信じる人いませんよ。 信じない私がおかしいと言うならば、私がスクリーニング用検査以外の話をしているところを指摘してみて下さい。

(無題) 削除/引用 No.10360-30 - 2022/03/31 (木) 09:13:59 - スンナ派 >[Re:29] おおさんは書きました : >この点では１〜５％ぐらいのFales positiveがでる。 Really？

(無題) 削除/引用 No.10360-29 - 2022/03/31 (木) 09:04:40 - おお >「カットオフ値がCt=40のPCRでの検査には問題があるのじゃなかろうか？」 問題があるとも言えるし、問題がないとも言えると思います。今回のパンデミックは未知のウイルスで感染を広げないための措置を取らなければならない上、PCRをして実際のプラクティカルにどれだけのウイルス量が検出されるのか、その時の症状はどうなのかわからない状態から始まっています。 ならば、理想に近い系が必要です。色々見ても今回の系はNTCは４０回してもノンスペは立ち上がっていません（この点が問題がない点で、出るまで回せばいいといういい加減なものではなくアッセイ系としてPCRの検出限界まで使用可能ということが示されている）。しかしながらPCRの性質上１コピーでも混じってしまったらFales positiveになる（これは問題点）。この点では１〜５％ぐらいのFales positiveがでる。（他のPCR検査についてどの程度のものが許容されているかは知りません） しかしながらPCR検査を始めた初期はスクリーニング検査として使っていません。症状がある人、あるいは濃厚接触者に対して検査する事になっていた。すなわちラフではあるけど確定検査で使っていたわけです。この時点では問題はさほど大きくありませんし、当時はロックダウン、外出規制などもありましたので、隔離された人だけが束縛されるという話ではありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.10360-28 - 2022/03/31 (木) 08:34:10 - おお >スクリーニングとしてのPCRはそれ用にきちんとデザインされてるから大丈夫です、という主張ですよね、これ。 ちがいます私は最初はあなたがスクリーニング用検査として考えていると思っていませんでした。臨床上で一つの検査方法として成り立つ系であるという話です。確定診断に使うべきだと申し上げたのもそういうことです（HIVの検査の流れのように）。 その上で現状今回のパンデミックに関してはPCRでスクリーニングしてきた経緯があるので、それについては専門家でも無理があるという議論がされてきているということを紹介しました。 その後のコメントをみるとスクリーニング用検査としてみていることがわかったので、その点に関しては意見が一致しますねと申し上げてきたのです。

(無題) 削除/引用 No.10360-27 - 2022/03/31 (木) 08:22:18 - タントピーシーアール 念のために書いておきますが、私が問題にしていたのは（そもそもこのスレでお聞きしたかったのは）NTCでもCt=32位で立ち上がることがあるけれど、これをどうしたものか？ということでした。だから、そこから派生して「カットオフ値がCt=40のPCRでの検査には問題があるのじゃなかろうか？」となった訳です。そういう微妙な検体じゃなくて、はっきり（例えばCt=28以下とか）とした立ち上がりがみられる確定診断に使うのなら問題は無いだろうね、と考えるのはごく普通の事です。いちいち「HIVでもスクリーニングには使わないが検査の手法としては使います」とか説明されなくても「そりゃそうだ」としか思いません。

(無題) 削除/引用 No.10360-26 - 2022/03/31 (木) 08:21:16 - タントピーシーアール >この診断方法はコロナらしい症状を持つ人に対して確定診断として使われるものという認識で（いろいろな医療関係者がそう言っている）その上で問題はないと申しております。 だから元々そういう意見であったのなら最初からそう書いておいて下さい、という話です。なにが「その上で」なのか。No.10360-9で「検出系のデザインにあたってPCRで検出できるから回せるだけ回して検出すればいいと考えて系を組むようであればそれは診断方法として承認されません」とか主張されていたではないですか。これは「きちんとデザインされているからこそ診断方法として承認されているんですよ」という主張でしょう。スクリーニングとしてのPCRはそれ用にきちんとデザインされてるから大丈夫です、という主張ですよね、これ。 ご自分で書いたNo.10360-6を読んで下さい。ああ、この書き手は限定条件（確定診断）では問題は無いと主張しているんだなあ、と読めますか？普通に読んで、私がその前の書き込みで話をしている条件に対して「問題はない」と主張しているでしょうこれ。「系を立ち上げるときにコピー数を振って実際にどのように系が働くか見ているはずですから」と書いてますが、この系ってのは、スクリーニング用のPCRの系なんですか？確定診断の為の系なんですか？ 「ノンスペを出さないような厳しい条件にして増幅効率を下げているのなら問題はないです」とまで書かれてるけれど、これは確定診断の為の系において必要なこととして書かれたんですか？高いCt値（35以上とか）で立ち上がってくるような検体とノンスぺを区別するための工夫として、つまりスクリーニングの為の系においての話としか読めないですよ、それまでの話の流れから。 書いていた内容が間違っていたとか、うっかり勘違いしていたとか、そういうのは誰にでもあることだから、本来はこんな目くじら立てて書かなきゃならないことでも無いんですよ。気づいた時点できちんと間違いだの勘違いだのを明確にしてから、その上でこれこれこうですとお話頂ければ。そういうの無しで、読み手のお前が私の意図を理解しなかった的に書かれてもなんでそんなことを言われなきゃならないのかわかりませんし、取り繕いの為だけに信じてもいなさそうな説明（増幅効率が100%ではないとか）をされたりとか、実にバカバカしいです。仮に、その教官自身が信じてもいないような内容で説得しにかかってくる教官がいたとして、そういう人に信頼をおけますか？ 最も問題なのは、それまでの主張がいきなり覆っている為にそれまでの説明は一体なんだったのか？となることです。No.10360-10までのおおさんの書き込みは、私が問題があると思うといったプロトコールを擁護するもので、それが途中でいきなり、スクリーニングに使うなら問題があるが確定診断に使うなら問題はない、となった訳です。え、それまでの擁護はスクリーニングに使う為の話じゃなかったの？となります（普通の読み手なら）。ふざけてるのか、あるいは馬鹿にしてるのかな？としか思えません。 念の為に確認しておきたいのですが、最初のおおさんの「ノンスペを出さないような厳しい条件にして増幅効率を下げているのなら問題はない」は、スクリーニングとしてのPCRに対しての話ですよね？その後の擁護的な書き込みもスクリーニングとしてのPCRに対しての話ですよね？ ずっとレスをきちんと読んできた私でも真意を掴みかねているのだから、後から読む人がいたら「結局どっちなの？最初の説明はなんだったの？」となると思うんですが。

(無題) 削除/引用 No.10360-25 - 2022/03/31 (木) 08:08:06 - スンナ派 Although the RATs read the samples containing large amounts of virus as positive, even the most sensitive RAT read the samples containing small amounts of virus as negative. Moreover, all RATs tested failed to detect viral antigens in several specimens from which the virus was isolated. The current RATs will likely miss some COVID-19 patients who are shedding infectious SARS-CoV-2. RATs: rapid antigen tests https://www.mdpi.com/1999-4915/12/12/1420/htm

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