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(無題) 削除/引用 No.10360-64 - 2022/04/20 (水) 07:29:20 - タントピーシーアール 皆様、コメントありがとうございます。 念の為に書いておきますと、私のところではNTCで毎回立ち上がる訳では無く、頻度でいうと10〜15プレートのうち1−2枚でそういう現象があります。大抵はCt値が37−38位だけれど、過去に32〜34で立ち上がったこともあります。で、周りのラボの人に聞いて回ったら、「同じようにNTCでも数字が出ることがある、でも35付近なら無視してそのまま進める、とのことでした。Ct=32なら無視で当然、という人もいました。」 >PFさん Ct=32を許容するか？というのは疑問は当然かと思います。私も同じように思ってトピを立ち上げたところがありますし、正直皆も当然許容できないだろうとも思っていました。しかし、目的の遺伝子、ハウスキーピング遺伝子共にCt=20−24位で立ち上がるのであれば、32-24=8で2の8乗=256倍の違いです。0.5%以下の量で、しかも毎回出る訳では無いたまにしか出ないものを重要視する必要はないのかもしれません。もちろん、目的遺伝子の発現がCt=30程度で見られる、などであれば話は別です。 おおさんが貼ってくださったリンクにあるMIQEのガイドラインでは、目的遺伝子のCtが35以下であれば、Ct=40以上でNTCで立ち上がっても無視できるとあります。Ct値で5の違いがあれば、32倍以上の差な訳で、SDやSEよりも小さくなることが多いレベルではないかと思います。確かにこれなら問題無いと思います（といって、目的遺伝子のCtが20でNTCは26だから差が十分あって定量に重大な影響を与えないから問題ないでしょ？と言われたらイマイチ首肯しかねるのですが。でも、現実的には与える影響が十分に小さいから無視しても構わないのか……）。 >NTCでCt=32を許容し、検量線がCt=30までしかカバーしない場合、サンプルのCt値はどれくらいから定量可能と考えますか？ この場合、検量線を引いた以上は、検量線がカバーする、直線性が保たれていることが保証されている区間だけを定量可能とするのだから、Ct=30を最低値とするべきではないでしょうか？検量線を引いたけれどもCt=29は駄目、とはならないのでは？ >よそさん、 hjdさん、bhkさん、おおさん hjdさんの「~35以上とかまでcycle数あげれば、それなりの頻度でなんか変なものが増幅されてくるのはたぶんqPCRしてる人なら経験的にわかってる」が今だとよくわかります。昔に普通のPCR（semi-quantitative PCRなんて言い方してましたね）をやってた頃は、サチュレートする前に止めるべくかなり少ないサイクル（25とか28とか）でPCRを止めることが多かったものです。常に40サイクル回していたら、もっと沢山のおかしなバンドを見ていたのかもしれません。私はhjdさんの説に同意します。40サイクル近くで出てくるものを排除するために多大なリソースを割くのはかなり無駄が多いように思います。 もちろん、おおさんが仰るように目的遺伝子がCt=32とか35でやっと立ち上がってくるようなlow copy numberのものであれば話は別です。昔、そのような発現量の低いスプライシングバリアントを研究していた時は、38サイクル回してRT無しでバンドが見えたら念の為に全部やり直ししてたことを思い出しました。

(無題) 削除/引用 No.10360-63 - 2022/04/20 (水) 00:23:51 - おお Low copy numberを見るような実験もあると思うから、ふつうのRt qPCRで遺伝子の発現をみる感覚のひとと違う人もいると思う。

(無題) 削除/引用 No.10360-62 - 2022/04/20 (水) 00:12:53 - bhk マジレスしないであげてくださいね

(無題) 削除/引用 No.10360-61 - 2022/04/19 (火) 21:39:45 - hjd NTCは私もしてるし、した方がいいとは思う. でも、~35以上とかまでcycle数あげれば、それなりの頻度でなんか変なものが増幅されてくるのはたぶんqPCRしてる人なら経験的にわかってるし、その度に『もし出たら徹底して問題解決』しないと先に進めないと言ったら、たぶん研究プロジェクトが止まる。今の時代、一つの遺伝子発現もqPCRだけでなくウェスタンや免疫染色、機能的実験など多角的に評価するのが普通の時代だし、そこまでqPCRのNTCのデータ一つに拘泥するのは研究全体における、かける時間のバランスや重要度からみてむしろあまり良いことはないような気がする

(無題) 削除/引用 No.10360-60 - 2022/04/19 (火) 01:43:53 - bhk はい、美しい心がけですね。

(無題) 削除/引用 No.10360-59 - 2022/04/18 (月) 13:16:11 - よそ 当方ではNTCから絶対に増幅産物が出ないように、徹底した注意しています。 PCRを使い始めた1990年ぐらいから、 NTCから増幅産物が出るのは、全体の実施数の1%も無く、 もし出たら徹底して問題解決してから、実験再開します。

(無題) 削除/引用 No.10360-58 - 2022/04/18 (月) 12:55:38 - PF ここの皆さん、NTCでCt=32を概ね許容するという事でしょうか？　私のような年寄りには信じられませんが、考えが古過ぎるのでしょうか？　念の為、確認させてもらえれると幸いです。 私の経験（大昔ですが）はほぼqRT-PCRに限定されるため、NTCというよりnon-RT controlでしたが、このネガコンでCt=32、立ち上がりが指数関数的で増幅効率２に近い、というような状況ならやり直しです。プライマーダイマーだったとしても、プライマーの作り直しか、プローブを使う系への変更でしょう。検量線は希釈系列（絶対定量ではない）ですが、Ct=30から32あたりでtechnical triplicatesが大きくブレた記憶もないです。 NTCでCt=32を許容し、検量線がCt=30までしかカバーしない場合、サンプルのCt値はどれくらいから定量可能と考えますか？　Ct29-30辺りは定量不能か、あるいはゼロとする？　NTCは系がきちんと走っている事を確認するためのネガコンであり、シングルコピーのコンタミでネガコンのPCRがかかる事が頻回に起きるなら、コンタミを避けるべく工夫するのが第一だと、思ってしまうのですが、、、 議論の中で、Ct値37-38と変わってきている事は承知しておりますが、あえて、最初のトピックで示されたCt＝32でお伺いします。基礎研究室でこれはまずいのでは？

(無題) 削除/引用 No.10360-57 - 2022/04/14 (木) 04:56:52 - タントピーシーアール >ててさん ありがとうございます。最初に検量線を引いて、検量線から外れた値は無視する、というのは理にかなっていると思います。サンプルはもちろん検量線内のわけですし。 絶対定量で検量線を引くこと自体に関しては、このフォーラムでも過去に色々と議論があったようで（検量線を引くのにつかうtemplate DNAはプラスミドやPCR産物で良いのか？実サンプルの最も濃度と高いものを希釈していったものにすべきではないか？等々）、細かいところまで突き詰めていくと色々と考えなきゃならないことありますね。今後必要に応じて検討してみたいと思います。 >hjdさん ありがとうございます。私の場合は一応melt curveの波形から、出てきたものは目的PCR産物と同じもの、ということになります。もっとも、以前コメントに書いたかもしれませんが、波形がガタガタ（やっぱりこの表現には問題あるな……）で、融解温度も微妙に違うこともあるので、仰るようなノイズの場合もあるかもしれません。 >だいたい35回くらいからようやく上がってるのは、使用してる水や器具についた微細なホコリなどに由来するコンタミのDNAがtempleteになってることがしばしばあるので、その辺のサイクル数から上がってくる検体のデータはあまり当てにならないと習いました。 仰る通りで、35サイクル以上で出てくるようなのは当てにならないことが多々あるのだと思います。コロナ騒動の初期の頃、バナナでもコロナが検出されたとかニュースが流れたことがあったようにおもいますが、こういったノイズと区別がついてなかったのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.10360-56 - 2022/04/11 (月) 18:35:20 - hjd だいたい35回くらいからようやく上がってるのは、使用してる水や器具についた微細なホコリなどに由来するコンタミのDNAがtempleteになってることがしばしばあるので、その辺のサイクル数から上がってくる検体のデータはあまり当てにならないと習いました。

(無題) 削除/引用 No.10360-55 - 2022/04/11 (月) 09:56:59 - てて もう終わりに向かいつつある話題で出遅れた感すごいですが、経験的にNTCでシグナルが出てくることはままあります。更に機械にオートでやらせてると訳の分からない波形をシグナルとして見なしたりすることもあります。なので、わたしは基本的にはqPCRする際は絶対定量するようにしてます。多少面倒くさいですが、段階希釈で検量線引くとやはりシグナルは寝てきて0にならない、というのは割とありますので、検討時にまずスタンダードだけテストで増やして検出限界を決めます。プライマーの設計が下手なのかもしれませんが... したがって、NTCでシグナルが出ようとわたしが引いた検量線の外側なのであれば全て検出限界以下ですので、いくらシグナルが出ようと数値としては意味のあるものではない、としてます。今のところ、これで査読時に文句言われたことはありません。

(無題) 削除/引用 No.10360-54 - 2022/04/09 (土) 10:59:07 - タントピーシーアール >BBBさん ありがとうございます。このスレを立ち上げてから色々考えましたが、一番最初だけNTCを準備して、これで問題（超強烈なプライマーダイマーの為にCt=30で波形が出るとか）が無ければ、二回目以降からはNTCを準備しないでも良いなと思うようになりました。 >心配ならNTCを含めたうえで、波形を見てください。 >マスターMIXにcDNAがコンタミすることを危惧していない限り、NTCでも測定することはメンタルが削れるだけの行為です。 仰る通りで、マスターミックスがコンタミしてNTCで比較的小さいCtでも波形が現れてしまうというような、はっきり言って可能性ゼロ（おそらくコンタミで生じている波形のCt値は、今まで例外なくかなり大きい）のなことを危惧するのでなければ、NTCを毎回準備するのは意味が無い行為ですね。今後はこの方向性で考えていきます。

(無題) 削除/引用 No.10360-53 - 2022/04/09 (土) 10:47:57 - タントピーシーアール >おおさん > NTCs should be included on each plate と紹介されたガイドラインにあって、shouldなんだから試行ごとにNTCのウェルを準備しろということと読めますが、これに対しておおさんのコメントは >これは意味合いというより選択肢というだけでさほど明確な理屈はありません。 です。仰る通りで、ガイドラインにはここの明確な数字が出てくるわけでもないですね。明確な数字も明確な理屈も無いけれど、まあNTCの数値が（見たい遺伝子でのCt値よりも）ある程度大きければ無視しても良いんじゃない、というのはなんだかガイドラインとしては弱いなあ、という気がします。 結局自分の頭で判断するしかない訳ですが、結局はかなり早い段階でiiiiさんが仰っていて、私も「現実的にはそれですよね」と同意していた、仮にNTCで出てもCt値がかなり大きいのであれば無視、ですね。 今の私の判断としては次のBBBさんの「用意する必要無し」に傾いています。お作法の為だけに意味のないウェルを用意するの物凄い無駄ですしね。 失礼ながら、（ご自分でも書かれておられますが）吸光度での検量線の話はあまりに的外れです。refでのゼロ点からの差を計測する吸光度の計測と、単にnegative controlとしてのNTCは意味合いが全然違うでしょう。勘弁して下さいよ。

(無題) 削除/引用 No.10360-52 - 2022/04/07 (木) 05:44:37 - BBB なんだか、議論の方向が良くわからないので読みなおしましたが、 シンプルにこれです。 3）そもそもNTCのウェルを準備しない。意味ないと思うから 心配ならNTCを含めたうえで、波形を見てください。 マスターMIXにcDNAがコンタミすることを危惧していない限り、NTCでも測定することはメンタルが削れるだけの行為です。

(無題) 削除/引用 No.10360-51 - 2022/04/07 (木) 04:13:43 - おお こちらをご存知ですか？そういえばと思い出して調べてみました。 https://academic.oup.com/clinchem/article/55/4/611/5631762 日本語での解説もあるようですが、 https://www.gene-quantification.de/miqe-japanese-version-2013.pdf どれくらい遵守されていて、どれくらい浸透しているかわかりませんが、qPCRが論文によく使われるようになってからいろいろな問題が指摘されるようになって上記のようなガイドラインができたものと聞いています（もしかしたらこれよりも前にそういう話があったかもしれませんけど）。 これによれば 7.3. controls and quantification calibrators ... NTCs should be included on each plate or batch of samples, and conditions for data rejection be established. For example, NTCs with Cqs ≥40 could be ignored if the Cq for the lowest concentration unknown is 35. batch of samplesをどう解釈していいかわかりませんが、基本PlateごとにNTCを含めるという指摘です。これによってそのqPCRの系が成り立っているか判断するということです。試薬等のコンタミとか、毎回作るMaster mixのブレによる異常を見極めるといったところでしょうか。 同時にNTCでCt（ここではCqとしてますが）が４０以上ので実際検出しているサンプルがCt３５以下であれば無視して良いとも書かれています。NTCが完全に理想的な状態でないとだめという話ではないということですね。 ＞NTCでCt値を出さない為のTipsはわかるのですが、それをすることの意味合いが正直見出せません。 これは意味合いというより選択肢というだけでさほど明確な理屈はありません。上記のようにガイドラインも測定範囲より数サイクルあとにNTCが立ち上がるのは測定に影響してないと判断できるとしてますし、わたしもそう思います。 一方例えば吸光度でもリファレンスを測定して０点を定めます。なのでNTCが０といえる状態を決めるという手順を踏むこともさほど違和感がないと思います。まあ３５サイクルで切ってそれ以降を見ないというのは影響がないと思われる範囲でのNTC立ち上がりを無視したとも言えるし、その検出力においてNTCで０と言えるとも言えるのでホントは一緒のこととも言えるかもしれません。（吸光度の話はまあ測定法の性質が全く違うので例え話程度ですけど）。 全体的に見てNTCのCt値がある程度以上高ければ出ても結果に影響なしという話は通ると思いますし、それなら系やパラメーターを見直す必要もないのでそれでいいのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.10360-50 - 2022/04/06 (水) 08:44:53 - タントピーシーアール >おおさん NTCでCt値を出さない為のTipsはわかるのですが、それをすることの意味合いが正直見出せません。同様なことはNo.10360-4であのさんが既に指摘しており、それに対して私は5で返信に書いたのですが、NTCをゼロにすること自体が目的化するのはどうなんでしょうか？ 結局、Ct=35以降は無視すると決めているのなら仰る通りそこまでサイクルを回さなくても良いし、NTCは一番初めの試行の時だけ準備して、そこでnon-specificに上がってくるもの（primer dimerとか？）がどの程度になるのか確認して、それが無視できる位小さいとわかったのならば、後は準備しなくてもよいのかなあと思うこともあります。それで、トピを上げる時に 3）そもそもNTCのウェルを準備しない。意味ないと思うから という選択肢を準備したのが実際のところです。 それと、私は基本的にduplicate(同一のウェルを二つ準備して、同時に計測する）で実験を行っています。 >おおさん、BBBさん おおさんが書かれた通りで、melt curveの一致から、増えているのは目的の遺伝子産物と同じもの、という判断になります。同じくおおさんからの（Melting Curveでどれほど正確にターゲットかどうか判断できるかという問題はあるのかもしれませんが）は私も同じように問題はあるのかもと思いますが、まあ、同じものだとみなすしかないですよね。 >おおさん、BBBさん、スンナ派さん、；；；；さん すいません、簡易抗原検査での診断の是非とかまで入れると、本来のトピからだいぶ外れてしまいますので、おおさん仰る通り別トピを立ち上げて頂けたらとおもいます。 （しつこいですが）PCRでの診断に関しての私の意見は、カットオフ値がCt=40である以上、クロスコンタミ等でカーブが出来てしまった検体も陽性者とみなすことになるので、問題がある、事実false positiveが5%近くもある、です。NTCでも40回まわすと後半（Ct35以降とか）に立ち上がってくることが多々ある、という人が私の周りで非常に多いことからこう考えるようになった次第です。皆様の周りでは、NTCっていっつもゼロですか？このあたり、実際のところの数字をお聞き出来ると嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.10360-49 - 2022/04/05 (火) 11:28:44 - おお 診断関連のことは仕切り直して議論したいことがあれば新しいスレ立ち上げるほうがよろしいかと。

(無題) 削除/引用 No.10360-48 - 2022/04/05 (火) 11:06:31 - ；；；； 簡易抗原検査は偽陰性が多すぎ、定量抗原検査はPCRと比較して安価でも迅速でもないでしょう。 ？？？何の話をされているのでしょうか？ここで会話している人たちの主語はPCR検査なはずなのですが？？？ 中国のニュース私も見ました。インターネットで検索すると簡単に見つかります。 同じアジアでも色々と対策が違って面白いですね。

(無題) 削除/引用 No.10360-47 - 2022/04/05 (火) 08:16:46 - スンナ派 > ここ２−３年で出現した新型のウィルスに対して、 > 公衆衛生や経済の面から、安価で迅速で簡易な方法を用いつつ、なるべく「偽陰性」にならなら方法として用いられているのかと理解しています。 簡易抗原検査は偽陰性が多すぎ、定量抗原検査はPCRと比較して安価でも迅速でもないでしょう。 > 最近中国がPCR2回以上の実施を開始してブーイングの嵐というニュースを見ました。 誰がブーイングしていたというニュースでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10360-46 - 2022/04/05 (火) 02:47:00 - おお >[Re:44] BBBさんは書きました : > 波形を確認してみてください。 > Ct値は波形から算出されているものであり、生理学的な意味やコンタミとは無関係に、CTが３０から４０で数値が計算されることがあります。 それは重要なことですね。ただ、質問主の主張としてはMelting curveからターゲットの配列が増幅されているようだと言うことらしいです（Melting Curveでどれほど正確にターゲットかどうか判断できるかという問題はあるのかもしれませんが）。ほんとにバックグランドのようなものがドリフトして上がっていっている場合ならCycle threshold値をあげるのがいいような気がします。

(無題) 削除/引用 No.10360-45 - 2022/04/05 (火) 02:36:58 - BBB コロナのスクリーニングの話をされている方がいらっしゃいますが、それは全く別の問題かと思います。 ここ２−３年で出現した新型のウィルスに対して、 公衆衛生や経済の面から、安価で迅速で簡易な方法を用いつつ、なるべく「偽陰性」にならなら方法として用いられているのかと理解しています。 100%確実に診断したいのであれば、他の手法を用いたり、複数回測定を行えばよいですが、経済的ではありません。最近中国がPCR2回以上の実施を開始してブーイングの嵐というニュースを見ました。

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