BioTechnicalフォーラム [ChIP assayのポジコンがありません。]

ChIP assayのポジコンがありません。

No.10350-TOPIC - 2022/03/18 (金) 11:22:52 - ChIP assay

Aという核タンパク質に対してChIPによって直接の下流遺伝子の同定を試みています。
しかしながら、このAという遺伝子はこれまでに下流遺伝子、結合パートナー分子がわかっていません。
転写因子として働く可能性はAの蛋白質ドメインから十分に推察できる状況です。
この場合に、この遺伝子を培養細胞で強制発現させ、IPをanti-normal rabbit IgG(negative control)、anti-A抗体（IP可能である優秀な抗体）で行いました。その後個別にPCRで下流遺伝子候補になりそうな遺伝子のpromoterやenhancerをPCRにて増幅しました。
結果としてはIPができているものの、anti-normal rabbit IgG、anti-A抗体で増幅に差がありませんでした。
これでは、ChIPがうまくいかなかったのか、候補が悪いのか判断できない状況です。
このサンプルのChIPがうまくいっているのか、評価するための良い方法はないでしょうか？
　

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No.10350-9 - 2022/03/19 (土) 20:09:06 - あかね

ChIPassayの一番のポイントは抗体です。
IPできる抗体とChIPできる抗体は同じとは限りません。
どうせ強制発現しているなら、FLAGなどのタグをつけて、FLAG抗体(M2)でChIPassayすることをススメル。

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No.10350-8 - 2022/03/19 (土) 01:24:08 - おお

＞RNA-seqとqPCRで確認済みです。

それは確かに候補かもしれませんけど、２次的な発現変化もかなりあるかもしれませんのでその中にどれほどあたりが含まれているのか、、、

ChIPもある意味トリッキーな方法論で、昔はそんなに使われなかった。ある程度の範囲ならとにかくゲルシフトを使うとかいうてもあるかもしれない。あるいは網羅的な解析をするか、、、

コンセンサス配列はわかってますか？

(無題)

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No.10350-7 - 2022/03/18 (金) 17:30:05 - ようじ

CHIP-seqして網羅的に見るのが確実な気がしました

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No.10350-6 - 2022/03/18 (金) 17:05:08 - seventh

egeriaさんの言われているChIP手法に対するポジコンに意味がない（つまり結合領域DNAの回収はうまくいっているしPCRによる定量もうまく行っている）と考えられているならChIPseqのようなターゲットを絞らない方法を使うしかないのでは。既知のデータがない場合、候補遺伝子の推定自体が難しいですし。

(無題)

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No.10350-5 - 2022/03/18 (金) 15:54:22 - ChIP+assay

＞ヒストンに対する抗体ならあらゆる領域が共沈すると思われるので、ポジコンにできるのではないでしょうか。
ありがとうございます。
それはその通りなのですが、結局目的sampleのIPでDNAが回収できているかが知りたいので、我々の目的では使いにくいと思います。
答えていただき、ありがとうございました。

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No.10350-4 - 2022/03/18 (金) 14:45:17 - egeria

ヒストンに対する抗体ならあらゆる領域が共沈すると思われるので、ポジコンにできるのではないでしょうか。

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No.10350-3 - 2022/03/18 (金) 14:40:09 - ChIP assay

>Aを強制発現した時に候補遺伝子の転写量が変化していることは確認されたのでしょうか。
こちらはRNA-seqとqPCRで確認済みです。

(無題)

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No.10350-2 - 2022/03/18 (金) 12:13:09 - s

特にその手の実験に詳しい訳ではないのですが、Aを強制発現した時に候補遺伝子の転写量が変化していることは確認されたのでしょうか。