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(無題) 削除/引用 No.10331-19 - 2022/03/18 (金) 14:10:45 - q１２w３重４r５ PVDFはもともと疎水性なので溶液を吸いにくいのでdot blotting向きではないと思います。そういう点では親水性のNC膜が適切と思います。

(無題) 削除/引用 No.10331-18 - 2022/03/18 (金) 12:54:07 - IN G25様 ご返信ありがとうございます。 確かにポアサイズの問題もありますね。 すい残しが出てしまうのも吸引力だけでなく、ポアサイズの問題で詰まってしまっている可能性もあるかもしれません。 NCと合わせて検討してみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10331-17 - 2022/03/11 (金) 22:42:29 - G25 たぶんPVDFはポアサイズが小さすぎて吸引濾過に向かないからおすすめしないということなんだろうと想像する。ちゃんと吸引できるならデメリットは思い浮かばないのだけど、どうだろうか？　おすすめしないとは書かれていてもwhyの説明はないようだけど。 逆にNCだとポアサイズが大きすぎ、しかも結合力が弱いので、吸引によって速い流速で濾過するとタンパク質がすっぽぬけてロスが大きく定量性が悪くなると思う。ウェスタンブロットでもNCはPVDFとは比較になrないくらいすっぽ抜ける（メンブレンを重ねてブロットして二枚目、三枚目にどれだけタンパク質が検出されるかで検証できる）。 吸引せず放置というのは怪我の功名で、むしろ吸引したほうが成績が悪いかも。 NCを使うなら、吸引しないでサンプルを少量スポットしてはドライアップして塗り重ねるのが一番ロスがなくていいかも。というかそういう使い方をしたことはある。 ちなみに、希釈系列でブロットするときは、過剰量のキャリアタンパク質（BSAなど)を含んだ希釈液でサンプルタンパク質を希釈したほうがいい（もちろんタンパク質総量を染めて検出するとかじゃなくて抗体などで検出する場合）。 希釈によって含まれるタンパク質の総量が大きく変わる場合、特に濃度の希薄な領域では、吸着ロスやメンブレンへの結合効率の変動などで、希釈の線形性が悪くなるので（ドットブロット、バキュームブロットに限らないが）。

(無題) 削除/引用 No.10331-16 - 2022/03/11 (金) 21:43:12 - IN TS様 ＞定量性を考えたとき、アプライしたサンプル内のタンパク質が、すべて、あるいはばらつきのない一定の割合でメンブレンに吸着しないといけないと思います。そういう意味で、急速でメンブレンを通過させたり、吸い残しがあったりということは、定量性を下げる気がします。残ってしまったウェルに少しバッファーを加えて、追加で通過させると、通過するタンパク質の量は同じになると思うので、定量性を改善できるかもしれません（想像の範囲です）。 全くもってその通りだと思います。バッファーを加えて追加で通過させる方法も試してみようかと思います。たくさんのアドバイスをいただきまして、ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.10331-15 - 2022/03/11 (金) 20:01:07 - あの すみません別スレに書きました

(無題) 削除/引用 No.10331-14 - 2022/03/11 (金) 19:54:35 - あの 様々なご意見をありがとうございます。当方も勉強いたします。 非常に興味深いのですが、AとかBとかの“薬物”の実態が不明で、 その上に、それぞれが一つの濃度だけ、といったことから、 さほど単純では無いだろうと想像しています。 数学的な詳細は識者の方の議論にお任せするとして、 現実的には、次のことも推薦します: 　考えられる統計解析は全部やってみる です。 最終的には、論文投稿する著者の責任で選択し、 投稿後にはレビューアー(場合によってエディターも) と共に最善の方法を選ぶことになると思います。 スレ主さんの健闘をお祈りします。

(無題) 削除/引用 No.10331-13 - 2022/03/11 (金) 19:22:30 - TS 定量性を考えたとき、アプライしたサンプル内のタンパク質が、すべて、あるいはばらつきのない一定の割合でメンブレンに吸着しないといけないと思います。そういう意味で、急速でメンブレンを通過させたり、吸い残しがあったりということは、定量性を下げる気がします。残ってしまったウェルに少しバッファーを加えて、追加で通過させると、通過するタンパク質の量は同じになると思うので、定量性を改善できるかもしれません（想像の範囲です）。どういうサンプルかわかりませんが、わたしは細胞溶解液だったので、結合させた後にPonceauSでタンパク質の吸着量を確認していました。WBの転写後にしばしば行われるのと同様です。

(無題) 削除/引用 No.10331-12 - 2022/03/11 (金) 18:16:05 - IN 先ほど私もバイオドットSFのマニュアルを確認させていただきましたが、確かに勧めないと書いてありましたので、やはりニトロセルロースの方が良さそうですね。

(無題) 削除/引用 No.10331-11 - 2022/03/11 (金) 18:14:55 - IN TS様 丁寧なご返信ありがとうございます。 もう一度ニトロセルロースとPVDF両者を試してみて、どちらを使おうか決めようと思います。 貴重なご意見、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10331-10 - 2022/03/11 (金) 18:10:26 - TS ちなみにバイオドットSFのマニュアルには、PVDFの使用は薦めないという記述が随所にあります。

(無題) 削除/引用 No.10331-9 - 2022/03/11 (金) 18:07:32 - TS わたしはドットブロットをPVDFでやったことがないので、何とも言えないです。 ただWBでも同じですが、ニトロセルロースの方がバックが出やすいということはあまりない気がします。 PVDFのほうがタンパク質の保持量と保持力が高いので、特にWBでは利点が多いと思います。たぶん強度や耐薬品性も高い。 吸い残しができたときに、それ以上うまく吸ってくれないのは、G25さんのおっしゃる通りと思います。優先的に液体がなくなったところを気体が抜けるので、残っているところを積極的に吸わなくなると思います。 PVDFだと自然落下では浸透しないのではないかと想像します。なんとなくですが。

(無題) 削除/引用 No.10331-8 - 2022/03/11 (金) 17:45:58 - IN TS様 たびたび失礼いたします。 実はニトロセルロースメンブレンでのブロットもやったことがあるのですが、バックとともにバンドのシグナルもかなり薄くなってしまって、評価ができないと思いPVDFを使っている経緯もあります。 その様な経験はございますでしょうか？ またPVDFとニトロセルロースメンブレンの違いはメタノールで親水化するかくらいだと思うのですが、その認識で間違い無いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10331-7 - 2022/03/11 (金) 17:17:00 - IN なるほど、ありがとうございます。 自然落下というのは初耳だったので、一回試してみようかと思います。 貴重な情報をありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10331-6 - 2022/03/11 (金) 17:07:46 - TS はい、そのとおりです。わたしはバイオラッドのバイオドットSFを使っていました。マニュアルによれば、特に定量解析には自然落下を薦めているようでした。少なくともこのやり方だとばらつきはとても少なくうまくいっていました。

(無題) 削除/引用 No.10331-5 - 2022/03/11 (金) 15:49:37 - IN TS様 ご意見ありがとうございます。 PVDFでも吸われているウェルもあるので、PVDFでも可能なのだと思います。 >わたしは、ニトリセルロースで、アプライしたあと、吸引しないで冷蔵庫で一晩静置してサンプルを落としています。だいたいきれいに落ち切っています。 →こちらはブロッティングマシーンに挟んで、アプライして吸引をかけないまま放置するといったイメージでしょうか

(無題) 削除/引用 No.10331-4 - 2022/03/11 (金) 13:59:32 - TS ドットブロットではニトロセルロールが良いのではないですか。PVDFできれいに吸われますかね。 わたしは、ニトリセルロースで、アプライしたあと、吸引しないで冷蔵庫で一晩静置してサンプルを落としています。だいたいきれいに落ち切っています。

(無題) 削除/引用 No.10331-3 - 2022/03/11 (金) 13:56:44 - IN G25様 早速のご回答ありがとうございます。 完全に吸われてしまったウェルから圧が逃げてしまっているのですね。そこに関しては全く考えていませんでした。次からパラフィルムを完全に吸い尽くされたウェルの上にかけるようにしようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10331-2 - 2022/03/11 (金) 13:15:55 - G25 液が吸い取られ尽くしたウェルは気密がなくなりますから、そこから圧が逃げて、液の残ったウェルに陰圧がかかりません。いつまで吸ってもそのままでしょう。 私は、液の残ったウェルを残して、空のウェルの上にパラフィルムなどをかけてシールします。最初からウェルの一部しか使わない場合もそうして使います。

ドットブロット 削除/引用 No.10331-1 - 2022/03/10 (木) 23:32:18 - IN ドットブロットで標的タンパクの量を簡易的に測定しています。 ドットブロッター(吸引をかける装置)で濾過をしてタンパク吸着を行なっているのですが、ウェルによって吸い残しが出てしまうことで困っています。 メンブレンはPVDFを使っており、乾燥してしまうことが原因なのかと思い、手早くアプライしても吸い残しが残ってしまいます。これは長時間待てばそのうち吸われていくものなのでしょうか？どのくらいの時間待てば良いのか分からず、ここで質問させていただきます。 ご意見よろしくお願いいたします。

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