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(無題) 削除/引用 No.10327-15 - 2022/03/20 (日) 09:38:26 - おお 決まったプロトコールがあってそれで実験できるならなりよりですが、研究者はそんなレールに敷かれた上ばかり走って来たのではありませんから、色々工夫をしてある意味泥臭いところから解析を進めている研究を色々目にする事はまあまあありました。 あるプレパレーションをして５０％の真皮が除けて、条件を振りながらときには３０％とか７５％とか言う具合だったとしてその中から表皮特異的なものは何かと言うのを抽出していったり（勝手に思いついた例ですが）というような具合です。 そういう意味で自身で独自の工夫をするのもありだと思います。例えばSDSなど強力なDetergentに数分晒すとかで組織のよりルーズなところは溶けていくと思えますし。処理後一部組織をみて評価しながら、RNAを取ってみるとかやって見れることではないのかなぁと漠然と思ってます。

(無題) 削除/引用 No.10327-14 - 2022/03/20 (日) 06:59:20 - jji 過酷な条件に長く置いて、３次元構造もなくなり、細胞間のコミュニケーションも絶たれた中で遺伝子発現に影響少なくという願いは、無理な話というか、研究者サイドの都合良すぎです。 うちらなら、古すぎと言われるかもしれないけどin situ ハイブリダイゼーションとか組織化学的なアプローチ考えるけど。専門外だけど、組織構造を維持したまま迅速に固定して、でいろいろやれるような、最近そういう方面の新技術はいろいろ出てきてるというのみるし。また非侵襲的な手法もなんかあった気がするし。 慣れている手持ちの手法で無理やり目的を達成するのでなく、目的にあった一番適切な手法を選んだ方がいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.10327-13 - 2022/03/17 (木) 23:50:47 - sat ありがとうございます。仰る通りですね。 RNAはwhole tissueでの評価に留めて、分離した組織はタンパクでの評価を検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.10327-12 - 2022/03/17 (木) 10:43:49 - おお 硫安も高濃度だと思います（３M以上あるのでは）。そんなイオン強度の高い状態で大抵の酵素が働くのはちょっと考えられません。

(無題) 削除/引用 No.10327-11 - 2022/03/16 (水) 21:23:19 - あの 酵素の中でも強力で厄介なRNA分解酵素が働かない状況で、 何らかの酵素を作用させるという発想に無理があります。 繰り返しになるので、先に当方が書いた意見を参考にしてください。

(無題) 削除/引用 No.10327-10 - 2022/03/16 (水) 15:03:30 - sat あの様 情報ありがとうございます。 DispaseはEDTAで阻害されてしまうようですね、、

(無題) 削除/引用 No.10327-9 - 2022/03/16 (水) 12:29:04 - あの ＝RNAlaterにDispaseを溶解したものでトライしてみます RNAlaterは、硫安、クエン酸、EDTAや硫酸が主成分ですが、Dispaseが作用するのですか？次などを参考してください https://www.fifthdimension.jp/wiki.cgi?page=RNAlater%A4%E2%A4%C9%A4%AD

(無題) 削除/引用 No.10327-8 - 2022/03/15 (火) 21:46:30 - sat 皆様ありがとうございます。 1M生食について調べてみましたが、分離に18-24時間とかなり時間がかかるようでRNAをintactで維持するのは難しいように思われました。 LN2内で、RNAlaterとともに瞬間凍結した後に再融解する方法は試してみようと思います。RNAlaterにDispaseを溶解したものでトライしてみます。 RNAlaterの融点が分かりませんが、これを0℃よりも下げることができればよりRNAが分解されずに維持しやすいようにも思いました。 解剖直後の皮膚は分離前の表皮と真皮が一緒になった状態のものです。 今回の目的はこれらを分離しそれぞれの転写状況を確認することです。

(無題) 削除/引用 No.10327-7 - 2022/03/10 (木) 12:48:52 - LPS 解剖直後にすでにやられているようですが、その方法はどうなんですか

(無題) 削除/引用 No.10327-6 - 2022/03/10 (木) 10:25:11 - G25 RNAの経時変化がクリティカルなときは、液体窒素で瞬間凍結するのに限るんですけど。 ただの思いつきですが、瞬間凍結したあとRNAlater中で解凍して、その後、組織の分離処理というようなことは可能ですかね。 培養細胞なんかで、瞬間凍結したあとTrizolのなかで解凍して抽出に進むというようなことはしますけど。

(無題) 削除/引用 No.10327-5 - 2022/03/10 (木) 10:04:22 - 88 split skinにする時の1M食塩水で処理するのは？ DNAもRNAもとったことないから読めるかは知らんけど

(無題) 削除/引用 No.10327-4 - 2022/03/09 (水) 20:17:06 - あの マウスで実施したことはありませんが、もっと大きな分厚い皮膚の動物でも 連続した層同士で、複雑に入り組んで、堅いので、完全に綺麗に取るのは困難だと思います。 迅速にはRNAlater なども浸透しないのも、当然です。 そのため、純度は諦めて、メス刃で、スクレープするぐらいしか思いつかないです。 ある程度　調べたい遺伝子が明確になったら、免疫染色等で見るぐらいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10327-3 - 2022/03/09 (水) 19:55:24 - sat G25様 ありがとうございます。 ammonium thiocyanateは存じ上げませんでした。 RNAlaterは一度トライしたことがあるのですが、やはり組織に浸透する前にRNaseにより分解されるためか、RNA発現は変化してしまっていました。 紹介いただいたトピにあるレーザーも考慮したことがあるのですが、マウスですとヒトと違い表皮層はかなり薄く、分離は困難ではないかと思っています。最終的には分離した皮膚組織をbulk RNA-seqにかけたいので、FFPE標本からのRNAのqualityという点でも不安が残ります。

(無題) 削除/引用 No.10327-2 - 2022/03/09 (水) 19:27:04 - G25 この板で表皮と真皮を分けるのにammonium thiocyanateを使う方法というのをしりました。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;start=5;Code=9817 文献検索するとかなり普及しているようですけど。 リンク先の質問のときもちょっと思ったのだけれどRNAlater (硫安？）のようなものでまずpereservationしてから、分離作業はできないものかと、

マウスの表皮と真皮の分離 削除/引用 No.10327-1 - 2022/03/09 (水) 18:21:12 - sat いつも拝見して勉強させていただいております。 マウスケラチノサイトでいくつかの遺伝子改変を行い皮膚の研究をしております。 フェノタイプを突き詰めていくにあたり、表皮ケラチノサイト、真皮線維芽細胞、免疫細胞等の相互作用を明らかにする必要があり、マウス解剖後、ケラチノサイト培養液に溶解したdispaseという中性プロテアーゼ（これ自体は皮膚の研究でよく使用されます）に漬け込み、4℃で一晩インキュベートすることで表皮と真皮を分離しておりますが、やはり解剖後かなり時間をおいてしまう影響か、解剖した直後の皮膚組織とは遺伝子発現がかなり変わってしまいます。 シングルセル解析等できれば本当はよいのでしょうが技術・金銭的に困難であり、生体の遺伝子発現状況を維持したまま表皮と真皮を分離する方法などありましたら教えていただけますでしょうか。 実際に経験がおありでなくても生化学的に何かsuggestionなどいただけますと幸いです。

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