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(無題) 削除/引用 No.10306-14 - 2022/03/09 (水) 14:11:40 - mont TSさん しつこくすみません。 よく考えてみたら、もしターボの高速転写システムでバンドが出なかったら、タンク式、23Vで一晩でやったら出るかな？と思いますね。単純に転写効率だけを比較するなら、タンク式、低電圧で長時間の方が全体の転写効率は上だと思っています。

(無題) 削除/引用 No.10306-13 - 2022/03/09 (水) 09:47:59 - mont TSさん 実際にゲルの転写残りをチェックしたこともありますが、上にいくにつれて転写残りがうっすら出て、それ以外の転写残りは低かったと記憶しています（３分ターボプロトコールで）。なので、相対的に高分子は転写効率は落ちると思います。当たり前と言えば当たり前ですが。自分の目的タンパク質が20-150Kdぐらい、最終的に検出できているので、それ以上追求したことがない、のが正直なところです。 元々TGXゲルは高分子領域の転写の効率はあまり良くないようです。同僚曰く、230Kdだとタンク式で一晩の方が転写効率は圧倒的に良かったそうです。ネットでも高分子の転写効率が良くないけどどうしたら良いか、という質問を何度か見かけました。でも、あまり納得のいく回答には出会ったことがありません。月並みに転写時間を長くする、、、程度です。 やっぱり、低分子も高分子も全部同じ転写効率、、、というのは少し虫が良過ぎて、分子量に合わせて条件を変えるのは仕方ないのかもしれません。やったことはありませんが、例えばゲルとメンブレンを切って、上と下の部分で転写条件を変えるとか？ あとはアプライする蛋白量を増やす、抗体やECLの感度を上げて、最終的に検出できれば良しとするか。 近々、高分子領域の蛋白を扱うので、今後ぼちぼち検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.10306-10 - 2022/03/09 (水) 08:11:24 - TS montさん ありがとうございます。もしかすると、うちのゲル厚が1.5mmであることも転写残りがあることに関係しているかもしれません。 最後に1つだけ教えてください。Stain freeを使われているということで、転写残りも確認されたりするのかなと想像するのですが、montさんのプロトコルでは高分子領域を除けば、あまり転写残りもないということでしょうか。 わたしもミニトランスブロットセルの1.5ｈ転写からTurboブロットに移行してきました。転写ムラはほとんどなくなったのですが、どうしもて転写残りは増えました。 いろいろお尋ねしてすみませんが、お手すきの時に教えてください。

(無題) 削除/引用 No.10306-9 - 2022/03/08 (火) 21:42:38 - mont アジ化ナトリウムは、キットのMSDSに書いてあったと記憶しています。 はい、お示しの転写バッファー+EcoClothを使っています。 私自身は、普通のゲルとTGXとで比較したことは無いので、「改善」するかはわかりまん。 ただ、ウチのラボでは、普通のゲルでもTGXでも、お示しの転写バッファーとEcoClothの組み合わせでターボ転写していて、特に実用上問題ないとの認識です。ただ、200kd以上の転写は苦手なようです。 タンク式の転写(約一時間~一晩)からTrans-blot Turbo のturboプログラム(最短3分)へ移行できたので、 この変化は「劇的な改善」だったのですが、比較の対象次第ですね。

(無題) 削除/引用 No.10306-8 - 2022/03/08 (火) 16:16:26 - TS montさん 詳しい情報ありがとうございます。大変参考になります。 バッファー中のアジ化ナトリウムは防腐目的でしょうか。 浸透圧が高いのでバクテリアが増えにくいかなと思ったのですが、冷蔵庫保管でもバクテリアが気になる感じでしょうか。 以前に関連トピでもやり取りさせてもらいましたね（No.9075）。 そのとき紹介いただいた転写バッファーを使われていますか。 > 1X Transfer buffer (pH ~9, do not adjust pH) > 300 mM Tris > 300 mM Glycine > 0.05% SDS > 20% EtOH 以前にご教授いただいたときに、普通のゲルでこのバッファーを試させてもらったのですが、その時は普通のゲルだったせいと思いますが、劇的な改善が見られなかったと記憶しています。 やっぱりTGXの組み合わせが重要なんですかね。 今度はこの自作のTGXでやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.10306-7 - 2022/03/07 (月) 13:58:53 - mont 私が試しているレシピです。使い始めてまだ日が浅く、溶液やゲルの保存性など、未知の部分が多いので、その点はご了承ください。 とりあえずこのレシピで通常のゲルと比べてみましたが、結果は全く遜色なく、かなり時間が節約できています。 (2X TGTT buffer) 100mM Triethanolamine 250mM Glycine 400mM Taurine 1% 2,2,2-Trichloroethanol 0.04% Sodium Azide Glycolic acid (0.2g/10 mLでpH6.5に調整、緩衝能が低いので入れすぎないように慎重に。pH6.5近くなったら、さらに薄めた溶液を使った方が良いかも) 実際のゲルの例 (Bio-rad mini-gel, 0.75mm、１枚）＊SDSを含みません。 4% Stacking gel DW 0.71 mL 2xTGTT Buffer 1mL 30% Acrylamide (37.5:1) 0.267 mL 10%APS 0.01mL TEMED 0.002mL 6% Resolving gel DW1.078mL 2xTGTT Buffer 2mL 30% Acrylamide (37.5:1)0.8mL Grycerol 0.1mL 10%APS0.02mL TEMED0.002mL 泳動バッファーは通常のTris-Glycineバッファーです。 1X: 25 mM Tris, 192 mM Gly, 0.1%SDS サンプルバッファーは、通常のLaemmliバッファーです。 300Vで泳動しても大丈夫です、ゲルは暖かくなりますが、泳動が乱れるほど熱くはなりませんでした。Bio-RadのTGXゲルと比べると、やや泳動が遅いです。濃度によりますが、ミニゲルで30-45分ぐらいが目安でしょうか。 TransferはBioRadのTrans-Blot Turboの３分（過去ログのバッファーとパッドの組み合わせで）が使えます。

(無題) 削除/引用 No.10306-6 - 2022/03/07 (月) 09:50:25 - TS みなさま、コメントありがとうございました。 Maxさん： 使用感のご返信ありがとうございます。使用されたことのある方を一人も知らなかったので、大変参考になります。e-pagelは使ってなく、自作の一般的なSDS-pageのレシピなので大丈夫そうです。あまりお金をかけたくないので、ルーチンでは購入したくないなとは思っているのですが、サンプルとか試せないか聞いてみようと思います。 おおさん： いろいろな情報ありがとうございます。知らないことも多く勉強になりました。市販のシステムはお金がかかるので避けたいのですが、Trice-tricineの分離範囲がそのように広いことがとても参考になりました。ちょっと調べて試してみようと思います。 montさま： 貴重な情報ありがとうございました。これも全く知りませんでした。ご紹介いただいたゲルを試してみようと思います。もしよろしければ、いくつか具体的にところを確認させてください。 ■2Xのレシピということなので、10mLのゲル溶液を作るときに5mL配合させればよいということですか（Tris-HClをいれないで）。 ■泳動バッファーは通常のもので大丈夫出でしょうか(1X: 25 mM Tris, 192 mM Gly, 0.1%SDS)。 ■SDS、APS、TEMEDなどは、一般的なプロトコールのようにゲル作成時に加えればよいですか。

(無題) 削除/引用 No.10306-5 - 2022/03/07 (月) 06:18:53 - mont 残念ながら、Allview PAGE bufferは使ったことがないのでコメントできないのですが、もし低コストで汎用性が高く、速いウェスタンのシステムをお探しでしたら、次のサイトに載っているゲルはいかがでしょう。 実際に試した感想としては、おすすめです。 自分の好きな濃度でゲルを作ることができ（お好みのグラディエントゲルも自作可）、泳動条件はミニゲルで300V、35-45分ぐらいで充分に高速です。バンドもシャープで分離もよいです。泳動バッファーは通常のTris-Glycineバッファーです。 2,2,2-Trichloroethanol (Final 0.5%)を加えると、Stain Freeになります。 Resolving gelにGlycerol(Final 2.5%)を加えると、stacking gelをすぐに重層することができます（ゲル作成の時間短縮）。 https://www.reddit.com/r/labrats/comments/jm2m7m/trisglycine_gel_with_acrylamide/gat274q/ どうもNuPAGEのシステムは、デタージェントを選ぶようで、RIPAがそのまま使えないなど、私の実験用途に合わず、最近は専ら上述のゲルを使用しています。

(無題) 削除/引用 No.10306-3 - 2022/03/05 (土) 08:30:29 - おお 例えばInvitrogenのNuPAGEですが、ゲルはBis-TrisでRunning bufferをMOPSかMESがえらべ、MESだと低分子領域の分解能もいいので比較的幅の広いサイズのタンパクが見れるようになっています。 www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0007891_NuPAGE_BisTris_MiniGels.pdf 他の会社ではゲルのバッファーはわかりませんが共通のげるで、泳動バッファーをTris-Glycine Tricine （多分Tris-Tricine）, Aspartate （多分Tris-Aspartate）と変えることで守備範囲を変えれる商品を売っています。 www.labiskoma.com/?c=Pre-Cast+Gels&v=EzWay-PAG-BC%2C+10X8%2C+4-12%25+1.0mm+10well%2FKG5010-BC そんなところで期待に添える回答ではありませんがこれらを参考に少し試してみようと思えるならと思いました。 また、SchäggerのTris-Tricineは低分子用という印象があるかもしれませんが、高分子領域もそんなにつまることなく分離できますので、よく使うことがあります。ゲルの濃度を９とか８％ぐらいまで下げると１０から百数十kDaまで見ることができる泳動パターンになると思います。 www.nature.com/articles/nprot.2006.4

(無題) 削除/引用 No.10306-2 - 2022/03/03 (木) 11:49:04 - Max 使用したことがあります。 自作ゲル（アトー、AE-6401ミニスラブゲル作製キット使用）で、18分程で泳動が終わりました。他のゲルと転写効率などは比較はしてませんが、ウェスタンもできました。 Allview PAGE bufferは、e-PAGELは使えないようなので、ゲル作製時間＋ゲル板を洗う時間と手間があるので、Allview PAGE buffer使用で泳動時間短縮とe-PAGELなどゲルを購入した場合のどちらが良いのかは、研究者の感覚によって違うかもしれません。 コストは、e-PAGELよりAllview PAGE bufferの方が安いでしょう。 ＞2.自作などが可能をされている方おりますか。あるいはレシピなどご存じですか。 ＞3.そもそもどういう原理なのでしょうか。 2、3は私も同じことを考えたことがありますが、文献があったらいいなあとは思っています」。

Allview PAGE bufferについて 削除/引用 No.10306-1 - 2022/03/02 (水) 08:22:27 - TS いつも勉強させてもらってます。 標記の製品について教えてください。 (すみません、URLを載せると投稿できなかったので、[Allview PAGE buffer」で検索ください。 SDS-PAGEのときに泳動バッファーとして使うだけで、 単一ゲルでグラジエントゲルのような分離ができるようです。 金額もそれほど高くなく（ミニゲル使用なら）、意外と簡単なものでできてしまうのかなとも感じました。 1.使用されたことある方がおりましたら、使用感を教えてください。 2.自作などが可能をされている方おりますか。あるいはレシピなどご存じですか。 3.そもそもどういう原理なのでしょうか。 どれか1つへのご返答でも助かります。よろしくお願いします。

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