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iiiiさん　ありがとうございます。 削除/引用 No.10298-6 - 2022/03/01 (火) 13:41:12 - Cell >[Re:5] iiiiさんは書きました : > コンペンセーションはしました（きちんと出来ました）か？ 　　リニアの図で、Iso で漏れ出しているところを発見して陽性にいる細胞を陰性へ移してダブルポジティブの細胞を0％に近づけました。 　同じようにコンペンセーションした技術さんの単染色は、きれいにひとつづつ山ができています。私の陽性細胞は、山というより低い丘みたいです。細胞集団がうっすら見える程度です。 　　FCBlockや抗体がよく洗浄されているかどうかは値に影響しますか？ 　洗浄がたりなかったのでしょうか？ 　　　 >[Re:4] iiiiさんは書きました : > 染色はCD3とF4/80の2色？それで先生からはオッケー出たのですか？ 　　　　 　　　CD3,F4/80の他に、最初は、CD4,CD8,CD86,CD11も測定しました。 　　その時にCD4,8,11は出たのですが、CD3,F4/80,CD86がでなかった為、 　　ひとまず、一番簡単なCD3,F4/80だけ染めてみることになった経過が 　　あります。

(無題) 削除/引用 No.10298-5 - 2022/03/01 (火) 08:03:09 - iiii コンペンセーションはしました（きちんと出来ました）か？

(無題) 削除/引用 No.10298-4 - 2022/03/01 (火) 08:00:33 - iiii 染色はCD3とF4/80の2色？それで先生からはオッケー出たのですか？

(無題) 削除/引用 No.10298-3 - 2022/03/01 (火) 07:59:10 - iiii サイトメトリーの検出のセットはうまくできていますか？ボルテージが高すぎたり低すぎたり、ログスケールなのかリニアーなのかとか。

(無題) 削除/引用 No.10298-2 - 2022/03/01 (火) 07:49:22 - iiii >[Re:1] Cellさんは書きました : > 同じ細胞を技術の方と一緒に分画、染色して、技術さんの行った細胞からは、CD3が、キレイにでました。 ご自分のは出なかったのですか？といことは技術さんとのやり方に違いがあるのでは？ > 質問は、 > > 1. リンパ球の分画で免疫細胞に影響するような手技はどんなことでしょう？ > 2. 一般に、細胞測定の実験で値が変わるような原因になる手技の間違えなどにはどんなものがありますか？ リンパ球の分画で免疫細胞に影響するような手技、細胞測定の実験で値が変わるような原因になる手技の間違え・・・うーん、難しいですね。脾臓を潰しすぎたり、PBSのpHが高すぎたり低すぎたりでも変わるでしょうし。 > 3. 今回の脾臓でのリンパ球分画からの免疫細胞CD3,F4/80の測定に考えられる問題の手技などんなことがありますでしょうか？ CD3は出そうな気がしますが。抗体はマウス抗体ですか？二次抗体も使ってます？ネガティブコントロールもとって陽性と陰性サンプルがわかるようにしていますか？

マウス脾臓からのリンパ球の分画と免疫細胞のフローサイト測定 削除/引用 No.10298-1 - 2022/02/28 (月) 10:33:30 - Cell こちらのフォーラムを発見して、実験全くの初心者でとても基本的な事ですがどうが、ご助言頂きたく勇気を出して投稿しています。 マウス脾臓のリンパ球の分画の後、フローサイトで免疫細胞を測定します。 問題は、CD3,F4/80（マクロファージ）の細胞が分画できません。 同じ細胞を技術の方と一緒に分画、染色して、技術さんの行った細胞からは、CD3が、キレイにでました。F4/80は、私のも技術さんのものもでませんでした。 細胞数を調整してからの抗体染色は、技術さんの検体も私が同じようにに行ったので、恐らく私の細胞分画操作に問題があるのかと思っております。 リンパ球分画の操作としては、脾臓を丁寧に潰し、セルストレーナーでこして、5％FBS/PBSで調整し、LysingBuffer5分かけて洗浄、細胞調整するだけの簡単な手技です。 　細胞は、氷上で冷やしていました。Lysing Bufferは、テキスト（フローサイトメトリー　羊土社）ではしておりませんが、プロトコール上しています。 　実験は、費用もかかりますし、きちんと問題をクリアにしてもう一度測定してみたいのですが、自分の操作のどこに問題があるのか、思いつきません。 　濾し方は、問題で以前は、ごみしかとれずやっと細胞集団をとれるようになりました。細胞は、LysingBufferの時以外は、冷やしています。 　 　細胞や、免疫細胞の状態を良くしておく基本的実験操作で自分が気づかないところで細胞を傷つけたりしているのでしょうか？ 質問は、 1. リンパ球の分画で免疫細胞に影響するような手技はどんなことでしょう？ 2. 一般に、細胞測定の実験で値が変わるような原因になる手技の間違えなどにはどんなものがありますか？ 3. 今回の脾臓でのリンパ球分画からの免疫細胞CD3,F4/80の測定に考えられる問題の手技などんなことがありますでしょうか？ お答えを頂くのに不足な説明などあるかと思います。その場合は、くまなく説明させて頂きます。どうかみなさんお豊富なご経験や知恵、知識をお貸し頂ければ大変嬉しく思います。どうか宜しくお願い致します。

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