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(無題) 削除/引用 No.10298-50 - 2022/03/04 (金) 00:52:29 - iiii >[Re:47] Cellさんは書きました : > 　　Isotypeで、陰性の山を出して、右のほうへ山の麓がかかっている部分、 > 　要は、蛍光色が漏れこんでいるところが少なくなるように、Compensationしました。 たぶんこれが原因でしょう。頑張って！

御礼 削除/引用 No.10298-49 - 2022/03/03 (木) 19:41:41 - Cell iiiiさま 　沢山、丁寧にご指導頂いて、本当にありがとうございます！ 　頑張って、もっともっと勉強に励みます。

(無題) 削除/引用 No.10298-48 - 2022/03/03 (木) 12:00:07 - iiii 学部生ですよね？大変失礼ですがもう少し理解を深められた方がいいかと思います。ご自分の研究やフローサイトメトリーについてディスカッションできる先輩はいらっしゃいますか？いらっしゃらないようでしたら単語をどんどん検索してください。 >[Re:47] Cellさんは書きました : > ＞＞ちなみに、「IsoTypeでCompensation」は、ざっくりどういう操作をされたのですか？ちょっと気になって。 > 　　Isotypeで、陰性の山を出して、右のほうへ山の麓がかかっている部分、 > 　要は、蛍光色が漏れこんでいるところが少なくなるように、Compensationしました。Compensationするときは、陽と陰と仮に線で分けた場合、右上にでてくる％が0になるように、要は漏れこみが0％近くになるようにCompensationのWindowを開けて数字をあげたり下げたりして調整しました。 > 　教わったのは、Ｆ１とＦ２，Ｆ２とＦ１は漏れこみが多いので凡そ必ずかけることで、後は、％が急に低くなるヒットするところを探します。 Compensationは蛍光補正ですね？蛍光の補正が必要なのはどんな時なのか、どの蛍光がどの検出器にもれ混むのか、理解されていますか？Isotypeで蛍光補正は私はしたことないです。もし流している細胞がCD3-PE-Cy7の1色でしか染めていないならcompensationの必要はありませんが、理解されていますか？ >[Re:46] Cellさんは書きました : > えっと、実験目的がわからないので深くは言えないのですが、CD3やCD4が何のマーカーかはご理解されているのですよね？ > 　　　　　CD3は、T細胞　　 > CD4は、制御性T細胞で　CD3は、CD4,CD8から成っていると理解しています。 > なので、CD4とCD8を合わせたらCD3以上になったらおかしいのですよね？ まぁ、そうですね。もし私がそのようなデータが出たらまずはフローサイトメトリーの検出方法を間違えたのか疑い、次にCD3の染色が失敗したのかなと思います。 私がやったのは、CD3陽性細胞を丸く（あるいはカクカクで丸っぽく囲う）ゲートをかけて、そのゲートをかけた細胞の内、CD4とCD8陽性細胞がどのくらいあるのかを見ました（と思います。あまり覚えていない）。CD3+CD4+の細胞割合とCD3+CD8+の細胞割合の比較だったような。 > 「ＣＤ３をＧａｔｅにかけた後のＣＤ３の細胞数」とは？ > 　　　　CD3の山形になった、陽性の部分（私の場合「丘」）を横線で選んで、例えばM1と名付けます。そのM1だけを別のWindowに出します。そうすると、その全部の細胞数が自動的にでてくるので、それをCD３の総数と思ってしまいました。 なるほど、なるほど。理解しました。 丘状態でしたらM1の始点がどうしても陰性部分と重なるようでしたら、いっそのこと縦軸を以前おっしゃってたSSCにしてドットプロットにして陽性ポピュレーションのゲートをカクカクで囲うという手もあるかも、と今思いましたが、わからなければ忘れてください。

Response-2 削除/引用 No.10298-47 - 2022/03/03 (木) 08:17:30 - Cell ＞＞ちなみに、「IsoTypeでCompensation」は、ざっくりどういう操作をされたのですか？ちょっと気になって。 　　お答えしていなかったですね。詳細まで確認してくださりありがとうございます。（きっとこういう姿勢がよい研究者をつくるのですね、学んでます） 　　Isotypeで、陰性の山を出して、右のほうへ山の麓がかかっている部分、 　要は、蛍光色が漏れこんでいるところが少なくなるように、Compensationしました。Compensationするときは、陽と陰と仮に線で分けた場合、右上にでてくる％が0になるように、要は漏れこみが0％近くになるようにCompensationのWindowを開けて数字をあげたり下げたりして調整しました。 　教わったのは、Ｆ１とＦ２，Ｆ２とＦ１は漏れこみが多いので凡そ必ずかけることで、後は、％が急に低くなるヒットするところを探します。 　　Ｆ４／８０は、先輩のものがあるので凡そ同じ位で調整しましたが、 　ＣＤ３は、自分でCompensationかけました。

Response-1 削除/引用 No.10298-46 - 2022/03/03 (木) 07:50:15 - Cell えっと、実験目的がわからないので深くは言えないのですが、CD3やCD4が何のマーカーかはご理解されているのですよね？ ひとまず今の目的は、（私があまりにできないので）脾臓のリンパ球の免疫細胞の測定です。そして、このありさまなので、CD３とF4/80がきちんととれる、ことです。（小学生みたいですが・・仕方ない・・。） 　　　　　CD3は、T細胞　　 CD4は、制御性T細胞で　CD3は、CD4,CD8から成っていると理解しています。 なので、CD4とCD8を合わせたらCD3以上になったらおかしいのですよね？ 　　　　　 > 　　＊PE-Cy7は、670ｎｍ以上と機器の説明書にありました。実際最も光るのは、775ｎｍ位が山のてっぺんでした！　勉強になります。 ・・・・なるほど > 　　　結果は、技術さんも見て下さいました。 技術さんや先輩は何かおっしゃらなかったですか？ 　　　私のは、出ていない、と。 > 　　　ＣＤ３をＧａｔｅにかけた後のＣＤ３の細胞数がフローサイト上で > 　　　明らかに私のものが少なくなるのです（半分以下）。 「ＣＤ３をＧａｔｅにかけた後のＣＤ３の細胞数」とは？ 　　　　CD3の山形になった、陽性の部分（私の場合「丘」）を横線で選んで、例えばM1と名付けます。そのM1だけを別のWindowに出します。そうすると、その全部の細胞数が自動的にでてくるので、それをCD３の総数と思ってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.10298-44 - 2022/03/02 (水) 23:43:31 - iiii >[Re:43] Cellさんは書きました : > iiiiさん > 今日は、ご自分の業務に加えて、この問題を一日一緒に考えて下さって、 > 　本当にありがとうございました。 いえいえ。 > 　そして、ご指摘の通り、実験操作なのですよね、きっと。 > 　　CD３の細胞の大きさは、500,000〜1,400,000位 > 　　CD4の細胞の大きさは、2,000,000周辺　　とフローサイトにでています。 えっと、実験目的がわからないので深くは言えないのですが、CD3やCD4が何のマーカーかはご理解されているのですよね？ > 　　＊PE-Cy7は、670ｎｍ以上と機器の説明書にありました。実際最も光るのは、775ｎｍ位が山のてっぺんでした！　勉強になります。 ・・・・なるほど >[Re:41] Cellさんは書きました : > > 脾臓を潰して抗体染色をしたのはあなた一人で行ったのですか？ > 　　脾臓は、同じマウスの脾臓を半分つにしました。 > 　　細胞数を測定するところからフローサイトに流すまで私が技術さんの分もやりました。 染色方法と手技は共通しているのに、技術さんがフローサイトに流すと山平地山になり、あなたが流すと山丘になる、ということですね？うーん、不思議です。でもあなたが準備した染色細胞が山平地山ならば、あなたの「細胞数を測定するところからフローサイトに流すまでの手技」に問題はないともとれますよね。 > 　　　結果は、技術さんも見て下さいました。 技術さんや先輩は何かおっしゃらなかったですか？ > 　　　スピンとは、遠心分離にかけることですか？ はい、そうです。 > 　　　ＣＤ３をＧａｔｅにかけた後のＣＤ３の細胞数がフローサイト上で > 　　　明らかに私のものが少なくなるのです（半分以下）。 「ＣＤ３をＧａｔｅにかけた後のＣＤ３の細胞数」とは？ ちなみに、「IsoTypeでCompensation」は、ざっくりどういう操作をされたのですか？ちょっと気になって。

Reply-3 削除/引用 No.10298-43 - 2022/03/02 (水) 19:40:14 - Cell iiiiさん 今日は、ご自分の業務に加えて、この問題を一日一緒に考えて下さって、 　本当にありがとうございました。 　 　そして、ご指摘の通り、実験操作なのですよね、きっと。 　　CD３の細胞の大きさは、500,000〜1,400,000位 　　CD4の細胞の大きさは、2,000,000周辺　　とフローサイトにでています。 　 　　脾臓の総細胞数は技術さんと同じだけとれてるにも関わらず、CD3もCD4も技術さんより取れてる細胞数が少ないのです。 　　小さい細胞を失ったということは、iiiiさんのご指摘の通り、 　　ピペット操作、吸引しすぎ、脾臓の磨り潰しの問題でしょうか。 　　１．脾臓の磨り潰しは、すばやく力をいれすぎないように 　　　　　 　　２．吸引時は、ペレットを吸いすぎないように 　　　　　（小さい細胞は、浮遊していることもあるのでしょうか） 　　３．セルストレーナーなどに残っていたりして、採取しきれていなかった 　　 　　４．Vortexのかけ方（かけすぎだと言われたことがあります） 　　 　　５．ピペット操作（雑だと言われたことがあります） 　　 　　　かなり気を使ってきたつもりなのですが、まだまだなのですね。　 　　　頑張ってみます！ 　　＊PE-Cy7は、670ｎｍ以上と機器の説明書にありました。実際最も光るのは、775ｎｍ位が山のてっぺんでした！　勉強になります。 　　ありがとうございます！！

Reply-2 削除/引用 No.10298-41 - 2022/03/02 (水) 18:15:14 - Cell > ちなみに横軸のチャンネルは合ってます？FL1-AとかFL1-Hとかありませんでしたっけ。PE-Cy7は多分FL3かな？機器によると思いますが。 　　その通りですFL3です。 > > 脾臓を潰して抗体染色をしたのはあなた一人で行ったのですか？ 　　脾臓は、同じマウスの脾臓を半分つにしました。 　　細胞数を測定するところからフローサイトに流すまで私が技術さんの分もやりました。 > 技術さんがフローサイトメトリーに流したサンプルは技術さんが作ったのですか？それともあなたが作ったのですか？（技術さんが行ったのはフローサイトメトリーだけ？） 　　　私がつくりました。フローサイトも私が流しました。 　　　結果は、技術さんも見て下さいました。 >[Re:37] iiiiさんは書きました : > うーん、「細胞数が技術さんと違う」ならば、ピペッティング操作ですかね？Washのときにスピンしてペレットにして、上澄みを取るときに取り過ぎて細胞も少し除いてしまった、とか。 　　　スピンとは、遠心分離にかけることですか？ 　　　細胞数は、同じ位とれました。（約　3ｘ10の７乗個） 　　　　 　　　ＣＤ３をＧａｔｅにかけた後のＣＤ３の細胞数がフローサイト上で 　　　明らかに私のものが少なくなるのです（半分以下）。 　　　＊ただ、私のピペット操作は、雑だと言われたことがあったので、 　　　　細胞数調整して抗体付けるところのピペット操作かも・・・。

Reply-1 削除/引用 No.10298-40 - 2022/03/02 (水) 18:07:49 - Cell 染色は技術さんのサンプルは技術さんが、あなたのサンプルはあなたが染めたものでしたっけ？それとも二人分あなたが染めて、一方を技術さんがフローサイトメトリーに流してもう一方をあなたが流してみた、という感じでしたか？ 　技術さんのサンプルは、私が自分のと一緒に染めて、フローサイトに流しました。 >[Re:34] Cellさんは書きました : > >[Re:32] iiiiさんは書きました : > > ちなみに、失礼ですがPE-Cy7はあなたの使っているフローサイトメトリーのどのレーザーとフィルターを用いているのか理解されていますか？先輩が測定したからということで大丈夫だ、ということで使用していますか？ > > 　　　レーザーは、＞670nmです。　 > 　　　フィルターは、わかりません。確認します。 PE-Cy7って670nmレーザーでエキサイトしますっけ？ 　　宿題にさせて下さい。

(無題) 削除/引用 No.10298-39 - 2022/03/02 (水) 17:30:01 - iiii ちなみに横軸のチャンネルは合ってます？FL1-AとかFL1-Hとかありませんでしたっけ。PE-Cy7は多分FL3かな？機器によると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.10298-38 - 2022/03/02 (水) 17:01:16 - iiii 「山のふもとに丘」でも一応陽性の染色は出来ているのでしょうが、CD3でしたら「山、平地、山」になりそうですし、技術さんはなっているんですよね。何が違うのか・・・ 確認したいのですが、 脾臓を潰して抗体染色をしたのはあなた一人で行ったのですか？ 技術さんがフローサイトメトリーに流したサンプルは技術さんが作ったのですか？それともあなたが作ったのですか？（技術さんが行ったのはフローサイトメトリーだけ？）

(無題) 削除/引用 No.10298-37 - 2022/03/02 (水) 16:39:32 - iiii うーん、「細胞数が技術さんと違う」ならば、ピペッティング操作ですかね？Washのときにスピンしてペレットにして、上澄みを取るときに取り過ぎて細胞も少し除いてしまった、とか。

(無題) 削除/引用 No.10298-36 - 2022/03/02 (水) 16:35:55 - iiii >[Re:33] Cellさんは書きました : > > > 例えばこのサンプルのフローサイトメトリーの操作は、 > > ・SSCとFSCでリンパ球細胞集団をゲートする。 > > 　　　　OKです。ふたつ集団がでるので、1,000,000のあたりと2,000,000の当たりで、後者の方が濃いです。 > 　　　　この集団に位置は、大きくずれないで毎回とれるようになりました。 ナイスです。 > > ・ゲートした細胞でPE-Cy7を検出する。縦軸がカウントか%で横軸がPE-Cy7の強度のグラフ。 > > 　　　　　「PE-Cy7の強度のグラフ」があってるかどうか不安ですが、 > 　縦軸が、SSCで横軸がPE-Cy7にしました。細胞集団は、10の2乗と一目盛り位から〜3乗個までの当たりにいます。 > > > ・アイソタイプやunstainは左側に山になるようにセットする。このセットでCD3-PE-Cy7を流すと左側とその右側の二つの山になる。 > > 　　　ここで、技術さんは、右も左も山がきれいにでるのですが、 > 　　　私のは、左の陰性の山にもうひとつ丘がくっついたみたいな、感じで突出した「山」という形になりません。 縦軸がSSCならば、ヒストグラムじゃなくてドットプロットの図ですか？そうなると、「山」ではなくて細胞集団のような絵になりません？ ただ、技術さんは左右別れた絵になってご自身のはならないということは、何でしょうね？染色は技術さんのサンプルは技術さんが、あなたのサンプルはあなたが染めたものでしたっけ？それとも二人分あなたが染めて、一方を技術さんがフローサイトメトリーに流してもう一方をあなたが流してみた、という感じでしたか？ >[Re:34] Cellさんは書きました : > >[Re:32] iiiiさんは書きました : > > ちなみに、失礼ですがPE-Cy7はあなたの使っているフローサイトメトリーのどのレーザーとフィルターを用いているのか理解されていますか？先輩が測定したからということで大丈夫だ、ということで使用していますか？ > > 　　　レーザーは、＞670nmです。　 > 　　　フィルターは、わかりません。確認します。 PE-Cy7って670nmレーザーでエキサイトしますっけ？

(無題) 削除/引用 No.10298-35 - 2022/03/02 (水) 16:17:09 - Cell > > >[Re:23] Cellさんは書きました : > > > 　　ちなみに、IsoTypeでCompensationかけて、CD3の陽性部分は、 > > > 技術さん　19〜23％　　　(ゲートの中の細胞数14,545) > > > 私　　　　10〜13.2％　　（ゲートの中の細胞数3,639）　です。 > > > あと、ゲートの中の細胞数、というのは、どういうゲートをかけたのですか？どのグラフから、何を狙ってのゲートですか？ リンパ球の集団をゲートしてから、そのゲートを新しいWindowにもってきて横軸をPE-Cy7とした時の細胞数を⇈に示しました。 > > データを目の前にしたいのはヤマヤマですが大丈夫ですよ。私もマウス脾臓を流したことがあるのですが正直それほど難しい実験でもなく、ごくごく基本的な検出だと思うのできっと出ますよ！4，8が出て3が出ないというのはおかしいのかな、と。いろいろと確認していきましょう。 　　ありがとうございます。そうなんです、難しくないのにでないので 　余計落ち込みます。リンパ球の分画方法にも問題があるのでしょうか。

お返事-４ 削除/引用 No.10298-34 - 2022/03/02 (水) 16:13:32 - Cell >[Re:32] iiiiさんは書きました : > ちなみに、失礼ですがPE-Cy7はあなたの使っているフローサイトメトリーのどのレーザーとフィルターを用いているのか理解されていますか？先輩が測定したからということで大丈夫だ、ということで使用していますか？ 　　　レーザーは、＞670nmです。　 　　　フィルターは、わかりません。確認します。 ちなみにCD3-PE-Cy7抗体は抗マウスですよね？ 　　　はい。そうです。

ゲートのかけ方 削除/引用 No.10298-33 - 2022/03/02 (水) 16:10:30 - Cell > 例えばこのサンプルのフローサイトメトリーの操作は、 > > ・SSCとFSCでリンパ球細胞集団をゲートする。 　　　　OKです。ふたつ集団がでるので、1,000,000のあたりと2,000,000の当たりで、後者の方が濃いです。 　　　　この集団に位置は、大きくずれないで毎回とれるようになりました。 > ・ゲートした細胞でPE-Cy7を検出する。縦軸がカウントか%で横軸がPE-Cy7の強度のグラフ。 　　　　　「PE-Cy7の強度のグラフ」があってるかどうか不安ですが、 　縦軸が、SSCで横軸がPE-Cy7にしました。細胞集団は、10の2乗と一目盛り位から〜3乗個までの当たりにいます。 > ・アイソタイプやunstainは左側に山になるようにセットする。このセットでCD3-PE-Cy7を流すと左側とその右側の二つの山になる。 　　　ここで、技術さんは、右も左も山がきれいにでるのですが、 　　　私のは、左の陰性の山にもうひとつ丘がくっついたみたいな、感じで突出した「山」という形になりません。

(無題) 削除/引用 No.10298-32 - 2022/03/02 (水) 15:47:27 - iiii ちなみに、失礼ですがPE-Cy7はあなたの使っているフローサイトメトリーのどのレーザーとフィルターを用いているのか理解されていますか？先輩が測定したからということで大丈夫だ、ということで使用していますか？

(無題) 削除/引用 No.10298-31 - 2022/03/02 (水) 15:28:48 - iiii ちなみにCD3-PE-Cy7抗体は抗マウスですよね？

(無題) 削除/引用 No.10298-30 - 2022/03/02 (水) 14:38:26 - iiii >[Re:24] iiiiさんは書きました : > >[Re:23] Cellさんは書きました : > > 　　ちなみに、IsoTypeでCompensationかけて、CD3の陽性部分は、 > > 技術さん　19〜23％　　　(ゲートの中の細胞数14,545) > > 私　　　　10〜13.2％　　（ゲートの中の細胞数3,639）　です。 > > ここを詳しく説明していただけますか？ > 「IsoTypeでCompensation」とはどういうことなのか？ あと、ゲートの中の細胞数、というのは、どういうゲートをかけたのですか？どのグラフから、何を狙ってのゲートですか？

(無題) 削除/引用 No.10298-29 - 2022/03/02 (水) 13:48:01 - iiii >[Re:26] Cellさんは書きました : > 　　データを目の前にしているわけでもないのにここまでお付き合い頂き、本当にありがとうございます。 データを目の前にしたいのはヤマヤマですが大丈夫ですよ。私もマウス脾臓を流したことがあるのですが正直それほど難しい実験でもなく、ごくごく基本的な検出だと思うのできっと出ますよ！4，8が出て3が出ないというのはおかしいのかな、と。いろいろと確認していきましょう。

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