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ウエスタンの泳動速度 トピック削除
No.10294-TOPIC - 2022/02/27 (日) 22:10:36 - けむ
ウエスタンの泳動速度は遅い方が綺麗になるのでしょうか？


これとは別に質問ですが、基本的にバンドは綺麗と言えば綺麗なのですが、ウェルの両端が少し尾を引くのが気になりました。これは泳動速度とは別の問題とも思うのですが、何かアドバイスありますでしょうか。
　
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No.10294-7 - 2022/03/01 (火) 22:15:17 - zwx絵rftγ７yh８う
遅すぎると泳動中に拡散してバンドがややぼーっとしてなんとなく締まりが無い感じに見えることがある。過度に発熱しない程度である程度速い方が細いバンドがバシッとした綺麗な感じになる。ウェスタンでシングルバンドが１本見えればいいみたいな実験ならどちらでも同じと思う。近接した２ほんのバンドを識別したいとかなら後者の方がいいともう。

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No.10294-6 - 2022/02/28 (月) 15:31:19 - るあい
経験則的には泳動速度（高電力）で奇麗さに影響するのはG25さんがあげている温度上昇による像の劣化、スマイリングだと思います。

ある程度の速度（電力）を保ちつつ泳動像をきれいにするには氷冷した泳動バッファーを使って泳動槽も氷で埋めると上記は抑えられます。

(無題) 削除/引用
No.10294-5 - 2022/02/28 (月) 13:12:42 - G25
常識的な電力の範囲で、常識的なタンパク質量なら、泳動速度によって分離の良し悪しは大差ないと思います。実用上、問題になるかどうかは別として、想像できる問題は

電力が低い、速度が遅い->
泳動速度に対して拡散速度が大きくなりバンドが拡散してぼける

電力が高い、速度が早い->
熱の発生でゲルの性能が劣化して分離能が下がる
熱の発生で温度ムラができてスマイリングする
分子ふるいに一気にタンパク質が殺到し、スメアがひどくなる(DNAの泳動だと歴然なんですけど）。

(無題) 削除/引用
No.10294-4 - 2022/02/28 (月) 11:15:12 - ばんどまん
追記ですが、スタッキング10 mA ランニング20mAは10％ゲル1枚の場合です。
7.5%なら7.5mA,15mAにし、
2枚同時に流すときは20mA 40 mA にしています。

(無題) 削除/引用
No.10294-3 - 2022/02/28 (月) 11:12:55 - ばんどまん
ウエスタンの泳動速度は遅い方が綺麗になるのでしょうか？

遅いほうがいいということは無いように思います。
（参考までにミニゲル1枚当たりスタッキング10 mAランニング20 mAで流しています。）

DNAのアクリルアミド泳動の話ですが、昔睡眠時間を確保するため1mAで一晩流したことがあります。（すぐ横で寝袋で寝てました）
その時は特に問題は無かったですが、拡散の危険はあると思います。

(無題) 削除/引用
No.10294-2 - 2022/02/27 (日) 22:32:59 - G25
>ウェルの両端が少し尾を引くのが気になりました。

サンプルをウェルに入れたときのメニスカスのせいだと思います。
サンプルはウェルの底に平らに積み上がるんじゃなくて、ウェルのしきりにそってせり上がってU字型になりますね。せり上がった部分は泳動でゲルに吸い込まれるまでに時差ができるし、タンパク質量も底だけ部分的に過剰になるので、バンドの両端がスメアになりがち。

・サンプルのボリュームを小さく抑え、メニスカスが深くならないようにする。
・サンプルをアプライしてからすぐに通電しないで、しばらく放置してバッファの拡散によってメニスカスが収まるのを待ってから泳動する。
・比重をつけるのに、グリセロールのように粘性の高い試薬ではメニスカスがひどくなるので、低粘性のものに変える（SDS pageでは経験ないですが、DNA泳動ではスクロースとか尿素で比重付けたりします）。

ウエスタンの泳動速度 削除/引用
No.10294-1 - 2022/02/27 (日) 22:10:36 - けむ
ウエスタンの泳動速度は遅い方が綺麗になるのでしょうか？


これとは別に質問ですが、基本的にバンドは綺麗と言えば綺麗なのですが、ウェルの両端が少し尾を引くのが気になりました。これは泳動速度とは別の問題とも思うのですが、何かアドバイスありますでしょうか。
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