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(無題) 削除/引用 No.10288-6 - 2022/02/28 (月) 20:57:47 - toto ECISは知らないのですが、単純に拡散係数が400um^2/sの水溶性小分子が25度の全く振動のない培地の中で拡散するとしてシミュレートすると、96wellという壁を考えないとすると中心から0.17mmの場所（96wellの壁の位置）と中心とでの（添加した分子）濃度の差は10時間後で5％程度になります。96wellという壁を考えるとこれよりもっとこの差は少なくなります。実際にはファン由来の振動が加わるはずで、加えて、チップを引き上げることで拡散が乱れるので、さらにこの値は小さくなり、ほぼ差は見られないくらいになるでしょう。 ただ1時間後では端の濃度は中心の62％以上になるため、短い時間だと多少は真ん中と端での濃度差が有意な影響を持つこともあるかもしれません。また、もちろん添加する溶液の比重が培地と異なれば別の話です。

(無題) 削除/引用 No.10288-5 - 2022/02/28 (月) 17:45:37 - そも 私はECISの使用経験はありませんが、たぶんこういう事がしたいのでしょうか。 ttps://www.jove.com/t/51300/electric-cell-substrate-impedance-sensing-for-quantification そのままのボリュームで行うのであれば、1 uL添加した後に容量大きめのピペットでピペッティングすれば良いだけでは？

(無題) 削除/引用 No.10288-4 - 2022/02/27 (日) 15:15:02 - おお >「拡散して平衡状態になる時期」はわからないと思います。 よくわからんけど拡散して平衡状態になると値も安定してこないですか？例えば濃いところがあるということは薄いところもありそこは細胞が影響を受けていませんよね。

(無題) 削除/引用 No.10288-3 - 2022/02/27 (日) 08:33:12 - 内皮 おおさん、コメントありがとうございます。 >これって経時的にモニターできますよね。 経時的にモニターできますが、モニター出来るのはbarrier functionを示す抵抗値だけです。薬剤の効果とbarrier functionがパラレルになっている訳ではないので、「拡散して平衡状態になる時期」はわからないと思います。 >培地の代わりにPBSでも入れて、濃いめの色素を加えて様子を見たり ありがとうございます。これはPBSにフェノールレッド入りのDMEMを加える形でやってみました。 1ulを入れる時の深さにもよりますが、ピペットから出したところから同心円状に赤い筋が見え、これは10分もすると見えなくなります。しかし、なにせ少ない量なので、本当に全体に均一に拡散した結果なのかどうかこれからだけだと自信がもてません。 試しに5ul、10ulと入れる量を変えてやってみたところ、同じようにピペットから射出した場所近辺に赤い筋（又は塊）のような形が見え、これは結構長くその場に残ります。1時間経ってもそれっぽいものがみえるような気もしますが、拡散の結果、流石に色が薄くなってくるのではっきりとはわかりません。 しかし、10ulを入れたウェルを二つ用意し、1時間後、片方をイエローチップで攪拌してみると、全体に色が良く混ざって明らかにもう片方のウェルとは見え方が異なるので、やはり静置しただけでは全体に均一に混ざったりはしないのかな、と思っています。 完全に均一にならないまでもある程度拡散してくれればそれで良い、と思っていましたが、案外に拡散していない様子でした。 ECIS実験の経験がある方、このようにすればうまく拡散するというアイデアがある方、他におられましたらよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.10288-2 - 2022/02/25 (金) 04:36:50 - おお これって経時的にモニターできますよね。ならば拡散して平衡状態になる時期もわかるわけですよね。 試験的に培地の代わりにPBSでも入れて、濃いめの色素を加えて様子を見たりするのも手かもしれません。

ECIS (TEER)で200ulに1ulを添加し揺らさずにそのままで大丈夫？ 削除/引用 No.10288-1 - 2022/02/24 (木) 10:50:35 - 内皮 最近、ECIS　（Electrical Cell-substrate Impedance sensing system) を使って血管内皮細胞のbarrier functionの計測を始めました。 barrierを悪くするような毒物と、それをレスキューするかもしれない薬剤とを一緒に添加して、実際にbarrierがレスキューされるかどうかを確認しています。 ECISは一度プレートをセットしたら外せません（いや、物理的には外せますが、外したら計測がずれるから外さないと習いました）。そして、添加する薬剤の量が極々微量です。96ウェルフォーマットでやっていて、1ウェルに200マイクロの培地が入っているところに、1マイクロの薬剤を添加したりしています。 そこで心配になったのですが、200マイクロに1マイクロを入れてプレートを揺らすこともせずにいて、この1マイクロは培地中をうまく拡散してウェル中の全細胞にきちんと行き渡っているのでしょうか？薬剤はPBSに溶けていますから、比重が重くて揺らさないとその場に沈んだまま、ということは無いとは思いますが、しかし実際に拡散して全体に行き渡っているかと聞かれたら自信はありません。 そこで、薬剤を10倍程度に希釈して200マイクロに10マイクロ添加ならもう少しうまく拡散するのではないかと思ったのですが、添加する量が大きいとそれだけで抵抗の値が変わって良くないから、1マイクロのままで良いのではという意見も出ました。ラボメンバー全員今まで使ったことがないので、手探り状態です。 経験のある方おられましたら、こういう場合はこうするのが定石、といったことを教えて頂けたら有り難いです。他のご意見もありがたく参考にさせて頂きます。よろしくお願い致します。 、

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