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(無題) 削除/引用 No.10287-6 - 2022/02/24 (木) 16:51:59 - mw 皆さまご回答ありがとうございます。 全然勉強不足でお恥ずかしいです。PCRの原理を改めて考えてみますとわかる内容でした、、。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10287-5 - 2022/02/24 (木) 12:14:41 - G25 PCRの過程で熱変性してインタクトなプラスミドではなくなっているだろうけど、大腸菌に入ってしまえば修復されて機能するようになるからね。

(無題) 削除/引用 No.10287-4 - 2022/02/24 (木) 12:12:22 - G25 プラスミドを消費する反応も分解する反応もないわけですから、インプットされただけ残っています。 それで良いかどうかはダウンストリームの実験次第だけど、 PCR産物のクローニングなんかだと、元のプラスミド由来の形質転換体が生じて厄介なことになるかも。 だからこそ、PCRベースのsite-directed mutagenesisの系だと、Dpn Iでテンプレートのプラスミドを分解したりするね。

(無題) 削除/引用 No.10287-3 - 2022/02/24 (木) 11:38:08 - てて テンプレートが消費される、というのがよくわかりません... 説明者さんにはPCRがどういう原理で反応してて、どうしてテンプレートが消費されると思ったのかを説明してほしいです なんなら早い酵素だと反応中に環状のプラスミドをぐるりと一周したりするのでもとのプラスミドよりも増えてる場合だってあるというのに...

(無題) 削除/引用 No.10287-2 - 2022/02/24 (木) 10:27:02 - おお ＞元のテンプレートが完全に消費されたと考えていいのでしょうか？ そうした場合なにか矛盾を感じませんか？１サイクル目とか終わったあとにできたDNAは次のサイクルでテンプレートになるわけですよ。増やしているのにその増やしたDNAもテンプレートになって消費されるとしたらDNAは増幅されるの？ で、PCRで２０サイクルで百万倍に増えるわけですよね。テンプレートのバンドはPCRで増えたバンドの百万分の１ですよ、理想的には。また増幅率などを考慮してテンプレートを反応溶液に入れるわけですよ。通常のアガローズゲルの電気泳動で簡単に見えるほどテンプレートを入れてますか？通常のアガローズゲルの電気泳動でせいぜいうまくやって数ngが見えるか見えないか（検出系によるかもしれないけど）ですよ。 ま、とにかくテンプレートは入っているという認識であなたの実験で入っていて問題ないか考えてみてください。

pcr後の泳動 削除/引用 No.10287-1 - 2022/02/24 (木) 10:03:35 - mw いつも勉強させて頂いてます。 プラスミドをテンプレートにして、特定領域をPCR増幅後、アガロース電気泳動しました。泳動結果は、その増幅された特定領域しか検出されなかったのですが、これは元のテンプレートが完全に消費されたと考えていいのでしょうか？（もちろん多少は残っているかもですが） テンプレートがあまり含まれてないなら目的バンド切り出してゲル抽出せず、そのままpcr productを反応に使用すればいいかなと思いました。次の実験で求める純度次第と判断してよろしいでしょうか？

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