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(無題) 削除/引用 No.10286-10 - 2022/02/28 (月) 20:30:37 - あの ダメだと思う。 ペプチド抗体の受託会社がやってるのは、定量性ない方法。 これ以上は、繰り返しなので、やめとく

(無題) 削除/引用 No.10286-9 - 2022/02/28 (月) 11:32:58 - やま 補足ですが、外注先にて合成ペプチドとキャリタンパクの結合は確認していただいておりました。説明不足で申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.10286-8 - 2022/02/28 (月) 11:27:53 - やま qq様 抗体を作るために用いた抗原ですが、何で架橋したかは前任者からの引き継ぎかつ、外注であったため分かりません。精製はprotein-A精製で行っています。 コントロールについてご教授頂きありがとうございます。 固相化の有無による発色の差については現在確認中です。 blockingには1%BSAを用いております。 あの様 外注先で行っていただいていた競合ELISAの方法を踏襲して行っており、原理的にも自分の理解では可能だと考えたのですがこの方法では難しいのでしょうか？ 固相したペプチドは、元のタンパクのエピトープ部分を標的とした15残基の産物のためネイティブの構造はある程度無視できると思ったのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.10286-7 - 2022/02/26 (土) 07:33:04 - あの 市販の様々なホルモン用イムノアッセイのキットが どのような測定原理なのか調べた方がよいですね。 定量性のないことやっているとしか見えない。

(無題) 削除/引用 No.10286-6 - 2022/02/25 (金) 21:44:47 - qq ペプチドは抗体を作るために用いた抗原だと考えてよいのでしょうか？ そうであれば、ペプチドは何に架橋して免疫したのでしょうか？KHLでしょうか？まさかBSAではないですよね？ ProteinA-Sepharoseで精製するよりも、抗原カラムで精製したいところだね。 ＞コントロールのウェル は、ペプチドを固定化していない（もしくは無関係なペプチドを固定化した）ブロッキングだけのウェルのことです。まさか発色しないよね？ ところで、ブロッキングには何を使っているのだろう？ 細々と言っても仕方ないことだけど、基本的には適切なコントロールが適切に機能していることを確認すればいいんじゃないかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.10286-5 - 2022/02/24 (木) 21:06:38 - あの たぶんそのやり方ではダメだと思う。固相したホルモンの立体構造がネイティブ とは全く違っているだろうから。 第一抗体がひとつしかないなら、そのIgGに対する第二抗体を固相した後に、 競合法イムノアッセイにすると運が良ければアッセイ系できる。 ホルモンの一部をビオチンなどで標識する必要があるけど。

(無題) 削除/引用 No.10286-4 - 2022/02/24 (木) 18:51:43 - やま ご回答いただきありがとうございます。 てて様 確かに抗体の力価が低い可能性はあると思います。 ただ、自分が想定したいホルモンの想定される濃度はかなり低いため何とか測定できないか検討を行っている次第です。 qq様 説明不足でした、申し訳ありません。 洗浄は各ステップで5回PBS-Tを用いて行っております。 コントロールが何を指すのか自分が理解できているか分かりませんが、一次抗体や二次抗体を入れていないウェルでは発色はほぼ見られません。 また、コントロールペプチド溶液ですがペプチドを粉から溶解させる際に用いた溶液はPBSでしたが、希釈の際には1%BSAを用いております。 理解不足で回答になっていない点が多々あるかと思います。 申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.10286-3 - 2022/02/24 (木) 11:48:45 - qq 本当に書いてある通りにやると全部同じ値になるように思うけど、それじゃ話にならないので、各ステップの後4回程度ウェルを洗っているとしましょう。 1)コントロールのウェルを作ると、発色しないよね？ 2)コントロールの1次抗体を用意すると、発色しないよね？ 3)コントロールの抗原で競合させると、発色低下しないよね？ 4)ペプチドを希釈するところで吸着している可能性を考えると、PBSで希釈するのではなく、コントロールペプチド溶液で希釈するとよいかもしれない。 と思います。

(無題) 削除/引用 No.10286-2 - 2022/02/24 (木) 11:25:42 - てて これ、4-parameter sigmoidの直線部分が0.8-20あたりで、0.32-0.8あたりはほとんど低濃度側の検出限界に近いってグラフに見えます 高濃度側の検出限界が見えてないのでフィッティング自体がかなり怪しくないですか？ 単純に抗体の力価が低いという可能性はありませんか？

ELISAの標準曲線の数値について 削除/引用 No.10286-1 - 2022/02/24 (木) 09:46:20 - やま 現在、proteinA精製した抗体と合成したペプチドを用いてELISA系の立ち上げを行っています。以下の手順で行っているのですが、思うように検量線がひけず困っています。 �@抗原を固相化4℃o.n �Ablocking 1h �B段階希釈した抗原と一次抗体をそれぞれチューブで1h競合反応させ、blockingしたプレートに添加する。 �CHRP標識二次抗体を添加し、45min �DTMBを添加、1M硫酸で発色停止 �EOD450で計測 濃度(ug/ml) 吸光値(ave) 0 0.704 0.032 0.588 0.16 0.512 0.8 0.493 4 0.415 20 0.145 最も濃い濃度の20ug/mlと4ug/mlの差が非常に大きく、検量線を引くとR=0.91程になってしまいます。また、20ug/mlを除いて検量線をひいてもR=0.985程でです。（検量線は4係数ロジスティック曲線を用いています。） また、濃度間で吸光値の差が小さいのも気になっています。それぞれのsdは0.01程度のため手技には大きな問題は無いと考えているのですが、何か考えられる原因はありますでしょうか。

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