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(無題) 削除/引用 No.10283-2 - 2022/02/24 (木) 04:06:26 - おお 実際に近くで状況を見てみないとなんとも言えないのだけど、、、 ＞自作のXL10Gは自分が作製したものではなく、聞くところによるとかなりコンピテンシーが低いそうです。 低くて実験に不都合なのであれば自分で作り直したらいいのではと、、、 ＞そこで4つほどピックアップしminiprepののちにシークエンスすると確かにものは採れていましたが、実はmini cultureでは大腸菌がなかなか増えてくれず、12-20 hでは濁りすら見られず、48時間ほど降ったらようやく濁ってきたのでmini prepしたという経緯があります。この時の大腸菌ペレットは黒かったです。 XL10Gだからというより、大腸菌以外のものが増えている可能性があると思います。なぜそうなったかはいろいろな原因があると思うので断言できませんが、出来上がったプラスミドが毒性のあるものをたまたま発現するようになったため大腸菌の増えが極端に悪くなったとか（コロニーで増えても液体培地で増えないことはたまにある）、そもそも培地がおかしかった（洗浄したあとデタージェントがたまたま残っていた器具を使って調製したとか、ないとは思うが抗生物質を間違えたとか）などなど。 コンピテントを作り直すか、近所のラボで違う株でもいいから使っているやつを分けてもらうとかして、ミニプレップで配列が読めているDNAをTransformationし直せばどうでしょうか。 また寒天上のコロニーは線画培養でもして、クローンを拾い直して、どうしても液体で増えないならコロニーをLBとかで懸濁して寒天一面に広げて、薄く膜ができているような感じまで増えてきたらそれを回収してプラスミドを精製してもいい（結構取れると思う）。

大腸菌が増えない（黒いペレット） 削除/引用 No.10283-1 - 2022/02/23 (水) 19:22:39 - KK 標題の件で質問させてください。 新しいラボではXL10 Goldを自作で増幅したものに、プラスミドを形質転換しています。 （前のラボではDH5aやBL21等は自作していました。） 自作のXL10Gは自分が作製したものではなく、聞くところによるとかなりコンピテンシーが低いそうです。 実際私もポジコンコロニーを出すのに苦労しています。 年度末ということもあり、菌を買うことができず、どうにか今あるものでと形質転換を試みており、先日15ほどのコロニーを出すことができました。一方、インサートなしのネガコンでは０コロニーでした。 そこで4つほどピックアップしminiprepののちにシークエンスすると確かにものは採れていましたが、実はmini cultureでは大腸菌がなかなか増えてくれず、12-20 hでは濁りすら見られず、48時間ほど降ったらようやく濁ってきたのでmini prepしたという経緯があります。この時の大腸菌ペレットは黒かったです。 振った培地の匂いを嗅いでも、DH5aを培養していた時に覚えている匂いはせず、一体何が増えてきているのだろうと疑問に思っています。 バクテリオファージが感染しているのでしょうか。 プラスミドのminiprepでのリカバリーもかなり低いです。 また、ようやく10コロニーを出したのですが、すぐにサテライトがその周りに生えてきました。 このようなことは初めてですが、年度末もあり菌を買い直すことはできないので、どうにか原因究明をしたいです。ご教示いただけましたら、幸いに存じます。

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