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(無題) 削除/引用 No.10275-15 - 2022/02/23 (水) 11:32:50 - たっつあん 皆さま、沢山の回答ありがとうございます！ 自分では見つけられなかった文献なども提示してくださり、大変感謝しております。 今後の方針としてはとりあえずスプレッド法でチップを都度変えるという条件で一度トライしたいと思います。 とても参考になりました。今後とも宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.10275-14 - 2022/02/23 (水) 09:37:38 - おお >[Re:13] セイキンさんは書きました : > >[Re:12] おおさんは書きました : > > 私は低い方（０）からまきたいなと思うんだけど。ないところから生えてこないので。前の持ち込みは無い溶液にも影響を与えるから。 > > ん？薄い方からまいてますよね？ > あ、そうでした。高いという言葉尻だけで反応してました。

(無題) 削除/引用 No.10275-13 - 2022/02/23 (水) 08:15:29 - セイキン >[Re:12] おおさんは書きました : > 私は低い方（０）からまきたいなと思うんだけど。ないところから生えてこないので。前の持ち込みは無い溶液にも影響を与えるから。 ん？薄い方からまいてますよね？

(無題) 削除/引用 No.10275-12 - 2022/02/23 (水) 06:34:57 - おお >滴下のときは最も希釈倍率の高い菌液から寒天培地にまいていますが、10000→10まで一つのチップです。 私は低い方（０）からまきたいなと思うんだけど。ないところから生えてこないので。前の持ち込みは無い溶液にも影響を与えるから。

(無題) 削除/引用 No.10275-11 - 2022/02/22 (火) 18:28:57 - s なるほど、スポットでは数えられるコロニー数が制限されるので、推定値の誤差が大きいと思っていたのですが、10個ぐらいスポットしてたくさん数えれば十分正確な値が出るのは道理ですね。参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.10275-10 - 2022/02/22 (火) 17:25:11 - G25 リンク先の論文を読んでほしいのだが、また自分自身でも試したから実際にルーティンで使っているのだが、 spot cultureがspread cultureに比べて定量性や再現性に劣るとは言えない。 >プレートにひろげるのとスポットとどちらが数値化に向いているかは明白だと思いますが。 「明白だと思う」ってだけじゃ論拠が弱い。

(無題) 削除/引用 No.10275-9 - 2022/02/22 (火) 17:02:06 - s 別に矛盾してるとかじゃなく、正確性と簡便性のトレードオフというだけのことでしょう。プレートにひろげるのとスポットとどちらが数値化に向いているかは明白だと思いますが。 ただ個人的には対照群との微妙な差については同じプレート上のスポットの画像のほうが生存率曲線より信頼できる、と感じてしまうところはあります。

(無題) 削除/引用 No.10275-8 - 2022/02/22 (火) 16:05:02 - noname > そんなことはない。少なくともspot culture assay, spot titer assay などという呼び名でmethodologyの論文や実際の研究で利用されている論文はかなりの数あります。例えば、 > https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1745-4581.2009.00182.x > > そもそも薬剤耐性や栄養要求性のようなこと調べるにして、ちゃんと数値化するにはcfuを求めなきゃならないんだから、そういう実験では使えるけど普通に生菌数を測定するのには使えない、ってのは矛盾している。 > 厳密に力価を出す実験でちゃんと用いられているとは知りませんでした。勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.10275-7 - 2022/02/22 (火) 15:24:48 - G25 >そもそもスポット培養って薬剤とか、栄養源の有り無しとかで差を見るための培養法であって、菌数の正確な定量には向かないのではないですか？ そんなことはない。少なくともspot culture assay, spot titer assay などという呼び名でmethodologyの論文や実際の研究で利用されている論文はかなりの数あります。例えば、 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1745-4581.2009.00182.x そもそも薬剤耐性や栄養要求性のようなこと調べるにして、ちゃんと数値化するにはcfuを求めなきゃならないんだから、そういう実験では使えるけど普通に生菌数を測定するのには使えない、ってのは矛盾している。

(無題) 削除/引用 No.10275-6 - 2022/02/22 (火) 13:48:30 - noname そもそもスポット培養って薬剤とか、栄養源の有り無しとかで差を見るための培養法であって、菌数の正確な定量には向かないのではないですか？ ざっくり見るだけなら良いと思いますが...

(無題) 削除/引用 No.10275-5 - 2022/02/22 (火) 11:39:36 - G25 あと、希釈の撹拌をピペッティングで済ますのも良くない。 マルチウェルディッシュなんかでピペッティングで希釈列作ると楽なんだけど、ちゃんとチュープを使ってボルテックスミキサーでしっかり混ぜたのとでは結果の綺麗さが段違い。

(無題) 削除/引用 No.10275-4 - 2022/02/22 (火) 11:31:45 - G25 >菌液を段階希釈する時に都度チップを変えていない。 これはクリティカルポイント。 普通にスプレッドする方法でも同様。 >滴下のときは最も希釈倍率の高い菌液から寒天培地にまいていますが10000→10まで一つのチップです。 これは許容

(無題) 削除/引用 No.10275-3 - 2022/02/22 (火) 09:21:47 - s スポット培養はスポット内のコロニー数が多いときには数えにくく、コロニー数が少ない時にはサンプリング誤差が大きいので、定量的な評価には向いていないと思います。対照群を横において、薬剤耐性や温度感受性(の差)を示す時にはよく使っていますが。 スプレッダーで広げる方法のほうが定量性が高いことをご自分で確認されたのですから、スポット培養に固執する必要はないような気がします。私の経験でも、スプレッダーで広げることによる誤差はほとんどないです。

(無題) 削除/引用 No.10275-2 - 2022/02/22 (火) 07:35:47 - セイキン すみません。何が理由かはわからないのですが、 > ちなみに、一般的な生菌数測定のように希釈液を寒天培地に100μLまいてコンラージ棒で広げた場合はおおよそ、希釈倍率とコロニー数は比例していました。 ということであれば、希釈までのステップには問題はないことになりますから、 > 原因として、 > ・希釈が正確にできていない→菌液を段階希釈する時に都度チップを変えていない。（例えば10〜10000倍希釈液まで一つのチップ）滴下のときは最も希釈倍率の高い菌液から寒天培地にまいていますが、10000→10まで一つのチップです。 の可能性は除外できますね。

生菌数測定がうまくいかない 削除/引用 No.10275-1 - 2022/02/22 (火) 07:11:29 - たっつぁん 生菌数を測定するために、スポット培養という手法を行っています。 スポット培養は一枚の寒天培地のシャーレを4つに区分けをし、一つの区画に任意の倍率で希釈した菌液を10μL滴下し、コンラージ棒などでは塗り広げずそのまま培養し、コロニーを出現させる方法です。例えば一枚の寒天培地に、10、100、1000、10000倍希釈を区画ごとに滴下し、コロニーがカウントできる倍率の時点で数えるみたいな感じです。 この方法だと、寒天培地の節約にもなるし、コンラージ棒で広げないため、より正確な生菌数がわかると思うのですが、、、 結果を見てみると文献よりもかなり高い希釈倍率までコロニーが出現してしまっています。また、希釈倍率とコロニー数が比例せず、採用する数によって推定生菌数が大きく変わってしまいます。 原因として、 ・希釈が正確にできていない→菌液を段階希釈する時に都度チップを変えていない。（例えば10〜10000倍希釈液まで一つのチップ）滴下のときは最も希釈倍率の高い菌液から寒天培地にまいていますが、10000→10まで一つのチップです。 ・滴下後、菌液が寒天培地に完全に染み込まないうちに培養室に入れてしまっていた。（なぜ完全に染み込んでから培養するのかもよくわかっていません） などが考えられたのですが、そのほかに何か原因はありますでしょうか。ちなみに、一般的な生菌数測定のように希釈液を寒天培地に100μLまいてコンラージ棒で広げた場合はおおよそ、希釈倍率とコロニー数は比例していました。 自分の知識が乏しく、大変初歩的な質問で恐縮ですが、お力を貸していただければと思います。

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