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(無題) 削除/引用 No.10271-16 - 2022/03/23 (水) 01:19:58 - プラスミド 774様 コロニーPCRも考えてもいいかもしれません、10個全部GFPでした、本当にどうして・・・そんなバカなことがあるのか・・・ 溶液ですか、私もTransformationはそんなに面倒ではないと思っているのですが、スタブの方がこういうトラブルは減るのだろうか？と考えたり。。100%向こうのせいというのが分かったわけではないのですが。 ｓ様 クレームは確認中です。送ってくれるといいのですが。 スタブか溶液か、情報いただき、ありがとうございます。値段違うのに、違う方が来ることもあるのですね。

(無題) 削除/引用 No.10271-15 - 2022/03/22 (火) 13:49:22 - s 全長PCRしたら配列を確認する必要が生じますし、もし元々コンタミしていたと思われるならクレームを言って再送してもらうか、それがだめなら買い直すのが結局一番早いと思います。 記憶があいまいなのですが、最近はスタブを希望してもプラスミド溶液で送られてきてるような。個人的にはどちらでも構わないのですが。

(無題) 削除/引用 No.10271-14 - 2022/03/22 (火) 11:32:19 - 774 オリジナルをtransformして出てきたコロニーをcolony direct PCRで数をこなせば1個くらい当たりそうな気がしますが、どうでしょうね？ 選べるなら溶液を選びます。 菌体で購入した経験がないことが大きいですが、個人的にはtransformする手間はほぼ０な感じなので、 輸送中のトラブルの可能性を考えると溶液の方が安心です。 sequenceしたクローンに当たりがあることをお祈りいたします。

(無題) 削除/引用 No.10271-13 - 2022/03/22 (火) 08:28:27 - プラスミド おお様 コンピテントは購入した物です。また、同時期にいれた別のプラスミドにはコンタミしていなかったので、今のところコンピテントや培地等はOKと信じています。 ご指摘ありがとうございます。 ついでに、（まずないと思いましたが）シークエンス結果がGFPの様でしたので、もともとの赤色蛍光タンパクに変異が絶妙に入って緑になったというのもないと思います。相同性50%弱ですし。

(無題) 削除/引用 No.10271-12 - 2022/03/22 (火) 03:49:56 - おお コンピテントは自作でしょうか？ これに混じっていたら今後同じことが、、、

(無題) 削除/引用 No.10271-11 - 2022/03/21 (月) 12:20:39 - プラスミド yu様 早急に、またご丁寧にコメントいただき、ありがとうございます。 本質的には同じように私には感じますが、１．より多めに拾う、２．1カットではなくてインサートを確認するために2かっとしたほうがいい、もしくは複数の切断個所をもつものでバンドサイズを確認した方が良い（おお様もご指摘）３．送ってきた相手を信用しすぎない、という事でしょうか。 勉強になります。ありがとうございます。 また、利便性では大腸菌とのことですね。そうなのかもしれません。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10271-10 - 2022/03/21 (月) 11:51:45 - yu 追記 他所からいただいたものについては、今後の実験のためにある程度plasmidを増やす必要があるので、その過程で際に先に書いたような方法で、必然的に自分で確認することになります。 購入仕様については利便性では大腸菌かなと思いますが、プラスミドでも大差ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.10271-9 - 2022/03/21 (月) 11:45:38 - yu たぶん本質的には同じようなものとおもますが一応書きます。 コンピテント化した大腸菌にヒートショック法で導入→amp+agar plateに播種→コロニー５〜10個or more拾う→拾ったそれぞれのコロニーはそれぞれamp+液体培地で数時間小規模培養（ここでのコンタミ注意）→一部集菌してminiprep→mapをもとに適切な制限酵素で切断してインサートを切り出す→電気泳動→予想される分子サイズにバンドがあること確認→本物認定→元の小規模培養を大量培養へ→midi or maxi prepでプラスミド精製→（一応、制限酵素処理と電気泳動でインサートを確認）→分注してフリーザーに保存 コンタミなど外れを増やして使ってしまうリスクは、今後の実験の要所要所でシングルコロニーと電気泳動でインサート確認をしていれば回避できると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.10271-8 - 2022/03/21 (月) 10:55:48 - プラスミド 774様 コメントありがとうございます。 自分がコンタミさせたとは、今のところ考えていません。pCAGGSベクターもGFPが入っているものも、今はまだ使っていないので。 また、たまたま同時に購入した別のプラスミドがあるのですが、そちらには緑に光るなぞのベクターはコンタミしていないと思います（トランスフェクションしても緑に光る細胞はありませんし、疑わしいサイズのバンドも見えません）。試薬はすべて共通のものを使用しています。 なお、コンタミの原因究明は今のところ考えていません、前述の理由で、送られてきたときにコンタミしていると思っていますので。ただ、購入した溶液にコンタミしてるかは確認してもいいとは思うのですが、購入した溶液はもうトランスフェクションできる様な量が無いので、それにGFPいりベクターがコンタミしているかを確認できるかは難しいと思っています。 現在、2回別の時にトランスフォーメーションしたプレートから、結果的に10個くらいコロニーは拾っていて、シークエンスをかけています。結果はまだです。そのうち別の時に取った合計3個を適当な細胞にトランスフェクションしているのですが、赤く光るのがオリジナルのモノですが、すべて緑に光っており、目的のオリジナルが１つも取れていません。 もうあきらめて、PCRでベクターをまるごと増幅しようかと考えています。 ご経験として溶液しかなかったとの事ですが、ちなみに、購入する際にどちらでも選べるとしたら、どちらを選ばれますでしょうか？ ゆ様 コメントありがとうございます。 私の記載が分かりにくかったのだと思いますが、今回はサブクローニングしているわけではなく、「購入したプラスミド」を「なにもいじらず」にトランスフォーメーションしています。もともと1種類のプラスミドしか入っていないと想定していました。 折角ですので過程を説明させていただきますと、最初は4つコロニーを拾い、1か所で切断できる酵素で切断し、バンドが1本、細かくは分かりませんが大体目的のサイズのところに見えることを確認しました。なお、プラスミドは赤色蛍光タンパクを発現させるだけのものです。 ゆ様でしたら、どのようにAddgeneから購入したプラスミドを手元で増やされ、目的のものと確認されますでしょうか？後学のために、ご教授いただけますと幸いでございます。もしよろしければ、購入する際に大腸菌とプラスミド溶液のどちらでも選べるとしたら、どちらを選ばれますかもご意見をいただけますと非常に幸いでございます。ご多忙と思いますが、なにとぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.10271-7 - 2022/03/20 (日) 06:33:35 - ゆ コロニー拾う時に外れを拾って、増やしてしまったのだと思うのですが。 「プラスミドのサイズーーーー電気泳動で確認』のとこが気になるのですが、コロニーはいくつか拾って、増やして、所定の制限酵素で切って、インサートのシグナルをそのサイズに見合う位置に検出できていますか。もし電気泳動でみるプラスミドのサイズで本物かどうか判断してるなら（大丈夫だと言ってそうやってる人いるのは知ってるけどけど）ちょっと違うと思う

(無題) 削除/引用 No.10271-6 - 2022/03/19 (土) 10:22:37 - 774 >購入したプラスミド溶液に違うベクターがコンタミしていたという事でしょうか。そしてトランスフォーメーション以降の過程で、それがドミナントになっていると。 購入時にコンタミしてたor操作中にコンタミしたかで、拾ったコロニーがハズレのものだった。 ということだろうと思います。 何種類かのプラスミドを増やしても上手くいかなかったとのことですが、増えてきたのは同じプラスミドでしょうか？ 関係ないプラスミドを増やしてみて増えてきたのが同じものかどうかで、いつコンタミしたのかがわかるでしょう。 あまり生産的でないので私だったらやりませんが。 オリジナルが目的のものだったのなら、いくつかシングルコロニーを拾って確認すれば目的のプラスミドを取れると思います。 ＞ちなみに、Addgeneからプラスミドを購入する際、大腸菌とプラスミド溶液、どちらで購入されますでしょうか？またその理由は何かございますでしょうか。 数ヶ月前にAddgeneから購入したときは溶液しかなかった気がします。 プラスミドの種類によるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10271-5 - 2022/03/18 (金) 22:47:52 - プラスミド 経過報告と、皆様のご経験・お考えのお伺いです。 トランスフォーメーションとミニプレップの後で取ったものは、オリジナルのモノとは違うものが増えていました。 あるときに違う色で光っていることが分かり、シークエンスを読んだところ、違う蛍光色素（GFP）がヒットしました。ベクターもpC1のはずだったのですが、シークエンスの結果を見ると、pCAGGSの可能性が高そうでした。 購入したプラスミド溶液に違うベクターがコンタミしていたという事でしょうか。そしてトランスフォーメーション以降の過程で、それがドミナントになっていると。 そのようなご経験はございますでしょうか？なお、当教室では他にプラスミドワークをしている人が現在おらず、LB培地なども作り直したので、試薬等からのコンタミはないのではないかと思っています。 ちなみに、Addgeneからプラスミドを購入する際、大腸菌とプラスミド溶液、どちらで購入されますでしょうか？またその理由は何かございますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10271-4 - 2022/02/22 (火) 14:52:14 - プラスミド KitKat様 ありがとうございます。大体のサイズしかチェックしていなかったので、複数切断パターンを試してみようと思います。 ミニプレップキットは購入後少なくとも5年はたっている様です、新しくはないですが、これくらいなら全然いける気がするのですが、そうでもないのでしょうか。少なくとも3年程度前にはTransfectionも出来たらしいです。 Miniprepのキットと、コンピテントは新しいものが今日届いていたので、試してみるつもりです。 おお様 同じく切断パターンとミニプレップについて、ご指摘いただきありがとうございます。MiniprepはTransfection gradeとわざわざ記載のモノを今回は購入しました。新しいMiniprepを使い、いくつか切断パターンを確認し、Transfectionを行なおうかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10271-3 - 2022/02/22 (火) 02:01:49 - おお ミニプレップは方法論やキットによって毒性が出たりDNA量が不正確になったりもしますのでそのあたりを私も疑いますね。 毒性はTriton X114を使ってエンドトキシンを除去する（個人的には６Mウレア存在下でエタ沈すると良くなると思っている、特に少量のばあいTX 114の二層分離はロスが大きいので）などの方法が有効です。RNAはまあ分解するしかないですが、、、 しかし全く発現しないのはちょっと解せないので、他の２、３箇所切るような制限酵素で切断パターンが予想どおりになっているかは確認してみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10271-2 - 2022/02/21 (月) 14:56:50 - KitKat 増やし直しの前後でプラスミドの切断パターンに変化がないのであれば、一番疑わしいのはミニプレップのキットでしょうね。同じキットで調製したプラスミドで上手く発現している人が同じラボにいますか？

購入したプラスミドが、増やした後は発現しない 削除/引用 No.10271-1 - 2022/02/21 (月) 05:19:03 - プラスミド いつも勉強させていただいております。 Addgeneでプラスミドを購入しました。 水溶液状態のモノを購入し、細胞にトランスフェクションしたところ、たんぱくの発現を確認できました（蛍光タンパクが入っており、光る細胞を確認しました）。 その後、プラスミドを増やすために、大腸菌にトランスフォーメーションしてミニプレップしたものを、同じ細胞にトランスフェクションしたのですが、たんぱくが発現しません（光りません）。 なお、増やした後のプラスミドのサイズは、電気泳動で確認して、おそらくあっている様に思います。 どのような原因が考えられますでしょうか。 なお、大腸菌状態の別種のプラスミドも購入し、ミニプレップし、トランスフェクションしたのですが、こちらも発現が確認できません（発現ベクターで、Western blotで目的蛋白の発現増加が認められません）。 転勤前には何度か似た実験はしてきましたので、根本的に作業を間違えている可能性は高くないだろうと思っています。使用したコンピテントやミニプレップのキットは初めて使うものではありましたが・・・。 私の移動後ではこの作業内容は初めてで、ここでの成功体験はありません。国が変わっても作業内容は変わらないと思うのですが。 申し訳ございませんが、なにかご意見をいただけますと幸いでございます。基本的なことを見落としているかもしれませんので、どのようなご意見でも歓迎です。 よろしくお願いいたします。

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