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RNAi配列はPCRで普通に増やせますか？ トピック削除
No.10266-TOPIC - 2022/02/18 (金) 22:14:01 - peacesnake
コンスト作成の時に、35Spro:attR1-GeneA-attR2:PDK intron: attR2-GeneA-attR1:OCStの部分はPCRで増やして、このあと、In fusionで使いますが、これの配列は普通に両側のPrimerを組んで、正確な長さを増やせますか？
　
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No.10266-6 - 2022/02/19 (土) 16:00:26 - peacesnake
> 35Spro:attR1-GeneA-attR2:PDK intron: attR2-GeneA-attR1:OCSt

>言わずもがなのことかもしれませんが、
このGene Aは反復ということですか。RNAiというから逆方向反復配列？　そのサイズは？

そうです。RNAiの逆方向反復配列です。サイズは大体500bpですが、そこは気になるところですね。

(無題) 削除/引用
No.10266-5 - 2022/02/19 (土) 14:07:33 - G25
> 35Spro:attR1-GeneA-attR2:PDK intron: attR2-GeneA-attR1:OCSt

言わずもがなのことかもしれませんが、
このGene Aは反復ということですか。RNAiというから逆方向反復配列？　そのサイズは？

(無題) 削除/引用
No.10266-4 - 2022/02/19 (土) 06:24:32 - おお
２７００bpの両末端にアニーリングするプライマーを使って、その中の１００0bpだけ増えるということはまず起こりません（プライマーに使った配列が途中にもあるような場合を除いて）。増えたというよりノンスペという判断を普通はします。

酵素やプライマーの相性は確かにあります。条件や酵素を変える、Nested PCRなどの方法論を変えるなどある程度やりくりしてPCRをかける手はあります。

In fusionは３ピースでコンストラクトを作れるのではないですか？それなら中央付近でプライマーを設定して、プラスミド、と２つのPCRフラグメントでつなげるてもあるのでは？

(無題) 削除/引用
No.10266-3 - 2022/02/19 (土) 01:18:58 - peacesnake
もともと、phallsgate 8 (GW)を使用して、GeneA(524bp)をLR反応させて入れました。そこでSanger sequencingでattR1-GeneA-attR2、attR2-GeneA-attR1:OCSt、PDK intron配列を確認できました。phallsgate8_GeneAのコンスト自体は問題ないと思います。そして、35Spro:attR1-GeneA-attR2:PDK intron: attR2-GeneA-attR1:OCSt（全長は約２７００bp）配列は、In fusionのはしこをつけるPrimerを使って、増やしたけど、結局１００0bpぐらいしか増やせないでした。Prime star GXLを使用しています。
これは酵素の相性、Primerの相性とか関係があるでしょうか？
これ以外の増やす方法はあるでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.10266-2 - 2022/02/18 (金) 23:50:39 - おお
お示しのプラスミドが個別のものでわかりにくいのだが、おそらくPCRはかかると思うしコンストラクトもできると思う（ただよくわからない相性みたいなもので、こういうのはたまにうまくいかなかったりもするけど、それはコンストラクトを作るとき全般の話）。

RNAi配列はPCRで普通に増やせますか？ 削除/引用
No.10266-1 - 2022/02/18 (金) 22:14:01 - peacesnake
コンスト作成の時に、35Spro:attR1-GeneA-attR2:PDK intron: attR2-GeneA-attR1:OCStの部分はPCRで増やして、このあと、In fusionで使いますが、これの配列は普通に両側のPrimerを組んで、正確な長さを増やせますか？
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