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(無題) 削除/引用 No.10249-12 - 2022/02/13 (日) 16:18:33 - PKK G25様 ご返信ありがとうございます。 大変参考になりました。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.10249-11 - 2022/02/13 (日) 15:05:30 - G25 > His tag、Halo tagどちらの領域もタグ領域(配列)で、精製方法や目的で使用するタグを変えるということでしょうか？ > 複数のタグがin-frameになっていて一個の融合タンパク質に両方のタグがつくようになっています。 精製にはどっちか一方だけ使うもよし、両方を組み合わせてもよし、戦術に関しても説明読んだら書いてあるんじゃないか。 > 上記のタグ領域の後のMCS内で、一般的にはインサートを挿入するかと思いますが、読み枠を合わせるために、MCS内の制限酵素領域を選択するイメージでしょうか？ > 制限酵素断端で入れるときは、繋がった時にin-frameになるような制限酵素を選びます。 どうしても合わない場合でも、陥没末端のfill-in, 突出末端の除去による平滑化、あるいは陥没末端のpartial fill-inなどで読み枠あわせをするテクニックがあります。 最近じゃインサートをPCRで調製するのが普通になっているので、読み枠が合うようにプライマーに制限酵素サイトを入れればいいし、in-fusionのように制限酵素やライゲースに依存しないLICもあるので、読み枠合わせは自由度が高くかつ簡単になりました。

(無題) 削除/引用 No.10249-10 - 2022/02/13 (日) 12:56:11 - PKK G25さま ご返信ありがとうございます。 ＞タグは特異的な結合性を利用して発現したタンパク質をアフィニティー精製するために付加するもの。His tagはヒスチジンの配位結合を利用してニッケルや銅を固定化したレジンでアフィニティー精製する。 His tag、Halo tagどちらの領域もタグ領域(配列)で、精製方法や目的で使用するタグを変えるということでしょうか？ すみません、もう一点質問させてよろしいでしょうか？ 上記のタグ領域の後のMCS内で、一般的にはインサートを挿入するかと思いますが、読み枠を合わせるために、MCS内の制限酵素領域を選択するイメージでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10249-9 - 2022/02/13 (日) 11:54:11 - G25 リンク先のシークエンスデータによれば、pH6HTNですから、先の書き込みにあったような典型的なN末タグ型のベクターです(pH6HTCはC末タグ型の姉妹品）。 タグは特異的な結合性を利用して発現したタンパク質をアフィニティー精製するために付加するもの。His tagはヒスチジンの配位結合を利用してニッケルや銅を固定化したレジンでアフィニティー精製する。 HoloTagは特定のケミカルと共有結合をするペプチドで、レジンとの共有結合で融合タンパク質を単離する。 pH6HTNの説明書を読めば、クローニングサイトとタグや読み枠の関係はわかるはず。 https://www.promega.jp/-/media/files/resources/protocols/product-information-sheets/g/ph6htn-his6halotag-t7-vector-protocol.pdf?rev=108f2627bb454727b4a97e0965d2a46d&la=en その他、用途、用法、HoloTagシステムの説明もメーカーサイトにある。 ttps://www.promega.jp/products/cloning-and-dna-markers/cloning-vectors-and-kits/ph6htn-and-ph6htc-his6halotag-t7-vectors/?catNum=G8031 ttps://www.promega.jp/products/protein-purification/protein-purification-kits/halotag-protein-purification-system/?catNum=G6280

(無題) 削除/引用 No.10249-8 - 2022/02/13 (日) 11:14:58 - PKK おおさま ご返信ありがとうございます。 おそらくよく使われている一般的なベクターなのですが、プロメガの下記のベクターになります。 https://www.promega.jp/products/cloning-and-dna-markers/cloning-vectors-and-kits/ph6htn-and-ph6htc-his6halotag-t7-vectors/~/media/F55C1E13434E408ABEFE058F637EB17E.ashx His6 regionは、6×Hisタグ配列領域で、 His6HaloTag® coding region、HaloTag® regionについては、6×Hisタグ配列に融合するタグ領域？だと認識しておりまして、間違っておりますでしょうか？ またHaloTag® linker region の具体的な役割がいまいちわからず・・ 素人質問ばかりで申し訳ありせん。

(無題) 削除/引用 No.10249-7 - 2022/02/13 (日) 10:02:24 - おお >プロモータ、RBS、開始コドン、N末タグはベクター側に設定されているのですね。 普通はそうですが、あなたのベクターについてはわかりませんので個人で確認するかベクター情報を開示してください。 >N末タグとは具体的にどのようなものになるのでしょうか？ あなたは使おうとしているベクターの仕様を把握してないのですか？ 市販でよく使われるものでもバリエーションがありHis x 6とかGSTとかMBPなど、His x 6にS tagがタンデムにつなげているものもあったと思います。膜移行のための配列もつけることがタンパクによってはありますし、青、白判定で使うようなLacZの入ったプラスミドも、利用しようと思えばできなくもないし。

(無題) 削除/引用 No.10249-6 - 2022/02/12 (土) 21:41:58 - PKK 皆様 ご返信ありがとうございます。 プロモータ、RBS、開始コドン、N末タグはベクター側に設定されているのですね。 挿入位置によっては、アミノ酸配列の組成が変わることがあるとのこと、承知しました。 調べたのですがいまいちイメージがつかめず。。不勉強で申し訳ありません、N末タグとは具体的にどのようなものになるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10249-5 - 2022/02/12 (土) 18:42:52 - G25 >[Re:3] nanasiさんは書きました : > 大抵の発言ベクターのMCSは開始コドンであるMetを含まない様にデザインされてると思うので、InsertのFirst Metが翻訳開始コドンになります。 > つまり、MCS内のどこに組み込むかはあまり関係ないでしょう。 > 不同意。 大腸菌の発現ベクターの多くは、N末タグと融合タンパク質として発現させるので、開始コドンはベクター側にある。また開始コドンの直前のいい位置にRBS (SD配列)がなければいけないので、開始コドンを持ったインサートを適当なサイトに組み込んでもだめ。 プロモータ、RBS、開始コドン、N末タグがベクターに提供されているところに、in-frame で(読み枠を一致させて)、興味の遺伝子のCDSを組み込むのが典型的。 N末にタグをつけない(かわりにC末タグをつけるような)ベクターでも、プロモータ、RBS、開始コドンはベクターにあって、Nde1なんかで開始コドンに目的のCDSをin-frameで繋いだりするんじゃないかな。 とにかくCDSのインサートを発現ベクターに組み込む時には、読み枠合わせを考えるのが当然。 MCSを3フレームに合わせてずらしたシリーズが用意されてるベクター製品もある。 そういうのとは別に、例えばN末タグに融合する場合、なるべくタグ直下のサイトにインサートをつなげた方がいいです。間に余計な制限酵素サイトが残っていると、発現量が下がったりする。多分パリンドローム配列が並んでいると転写や翻訳が妨げられるんだろう。

(無題) 削除/引用 No.10249-3 - 2022/02/12 (土) 15:24:22 - nanasi 大抵の発言ベクターのMCSは開始コドンであるMetを含まない様にデザインされてると思うので、InsertのFirst Metが翻訳開始コドンになります。 つまり、MCS内のどこに組み込むかはあまり関係ないでしょう。 MCS外だったら、真核細胞だったらPoly-Aの位置とかで制約はあると思いますが そういうのが大丈夫ならMCS外でも良いのでは？

(無題) 削除/引用 No.10249-2 - 2022/02/12 (土) 03:39:04 - おお >[Re:1] PKKさんは書きました : 。 > その場合、目的の遺伝子のタンパク質を正しく発現させるには、MCS内のどの位置に組み込むかで、塩基のずれが生じて正しいアミノ酸が翻訳されない事があったりしますか？ あります。N末にタグがあるならなおさらです。N末にタグがないなら ribosomal binding site (RBS) （Shine–Dalgarno (SD) sequenceともいう）からスタートコドンの距離が重要なのでMCSの位置により発現しなくなる可能性はあると思うが、そんなMCSは役に立たないのでそんなベクターがあるのかどうか、、、 > また組み込む位置は必ずMCS内に限定されますか？プロモーター領域に影響しないなら、MCSの下流とかに組み込んでも問題無いでしょうか？ > pETなどの発現ベクターではMCSの上流にスタートコドンに合わせて制限酵素認識部位を設定していて、N-末のタグを除いてそこからInsertの配列を翻訳することが可能。 またMCS下流の場合はN-末にタグがあるならそのフレームに合わせて挿入するなら発現は可能だが、途中にストップコドンが入らないこと、ターミネーターより上流であることが必要。 使うつもりのプラスミドを開示してもらえるとアドバイスし易いかもしれませんが、もし上記のことがあまり理解できないのであれば、それぞれの用語など調べるなど勉強してください。そうでないと結局アドバイスも理解できないかもしれないので。

発現ベクター内のインサートの組み込み位置について 削除/引用 No.10249-1 - 2022/02/12 (土) 01:00:16 - PKK 素人質問だと思いますが、教えていただきたい事があります。 発現ベクターへのクローニングで、組み込んだ遺伝子を大腸菌内で発現させる際の事です。 その場合、目的の遺伝子のタンパク質を正しく発現させるには、MCS内のどの位置に組み込むかで、塩基のずれが生じて正しいアミノ酸が翻訳されない事があったりしますか？ また組み込む位置は必ずMCS内に限定されますか？プロモーター領域に影響しないなら、MCSの下流とかに組み込んでも問題無いでしょうか？ 的外れなことを聞いていたら申し訳ありません。 どうぞ宜しくお願いします。

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