BioTechnicalフォーラム [カバーグラスが傾かない技はありませんか？]

カバーグラスが傾かない技はありませんか？

No.10246-TOPIC - 2022/02/11 (金) 05:56:30 - nak

12mmカバーグラス上で培養した細胞を、染色してスライドグラスに張り付けてConfocal顕微鏡で観察しています。
時折カバーグラスがわずかに傾いて接着して、顕微鏡観察時に視野の一部が走査範囲をZ軸方向に逸脱してしまうことがあります（私の言いたいこと、伝わっておりますでしょうか）。

分厚い細胞を観察しているときは多少傾いてもきれいな写真になるのですが、扁平な細胞を観察するときは写真の端の方は暗く映り、見栄えがしません。
見栄えの問題だけではなく、蛍光を定量したい時などは正確な結果が得られません。

Z stackを用いて再構成するなど撮影の際やその後にもやれることはありますけれど、そもそもカバーグラスが傾いていなければきれいで誰にも文句のない写真がバシッと撮れるわけで、なんとか傾かないようにする技は無いものかと思案しています。

皆様の中で、「こうすると傾かない」というようなお知恵、技をお持ちの方がおられましたらお教えくださいませんか？
あるいは、マウント剤を変えたら解決するということもございますか？ラボではProrong goldを用いており、いつも1枚の12mmカバーグラスに対して5uLを用いています。

どうかよろしくお願いいたします。
　

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No.10246-14 - 2022/02/19 (土) 09:22:59 - あの

念のため次の２点確認してみてください

顕微鏡本体の芯だしなどは適切か

高すぎる倍率のレンズ使っていないか
低倍率でも十分に高画質なので、広めにとってから
ROIとして切り出すのもありです。

(無題)

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No.10246-13 - 2022/02/19 (土) 04:01:58 - あ

手のひらに薄くワセリン(無ければハンドクリームでも)塗って、
カバーガラスの向かい合う二辺でそのワセリンをこすりとります。(このときカバーガラスと手は90度になるようして手を削るイメージでスッスッと)
そうするとカバーガラスとスライドガラスの間に0.数ミリの隙間が出来るのでズレないです。

(無題)

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No.10246-12 - 2022/02/18 (金) 02:34:40 - mont

ibidiのチャンバースライドは、染色後にシリコンの仕切りを簡単に外すことができます。片側をちょっと持ち上げるだけで、ペロンと綺麗に剥がれます。接着剤を使っていないので跡も残りません。また、シリコンは再利用できるので、意外とコストパフォーマンスの高い製品だと思います。再利用する際は、蓋は捨てて、乾熱滅菌後のシリコン・スライドを滅菌シャーレに入れて使ってます。カバーグラスに貼り付ければ、Live imagingにも再利用できます。

あまりに綺麗に剥がれるので、カバーグラスを載せると、どこがウェルなのかわからなくなります。なので、シリコンの仕切りを剥がす直前に、スライドグラスの裏側から油性のマーカーでウェルの形をなぞっておくと、顕微鏡で観察する時の目安になって便利ですよ。

(無題)

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No.10246-11 - 2022/02/17 (木) 23:42:57 - G25

マウントしてすぐじゃなくて、一晩〜数日とか、マッペかなんかで平らに置いてから検鏡する。
硬化型のマウント剤(Prolong gold はそうみたいだが)じゃないほうがいいかも。古典的なグリセロールとかベクタシールドとか。紛らわしいことに他社製品のProlong Diamondっちゅうのはグリセロールベースで固化しないようだ。

ありがとうございます！

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No.10246-10 - 2022/02/17 (木) 22:39:57 - nak

すみません、色々とありまして返信が遅れました。
たくさんのコメントありがとうございます。大変勉強になりました。

＞iiiiさん
いやその通り、圧迫するのもやってみましたが、汚くなっちゃったり、結局カバーグラスがずれたりで良いことが無かったので、やらなくなりました。
カバーグラスを置いた後にGentleにチョンチョンと押しつけてみると少しマシにはなる気はしますが。。。

顕微鏡での観察側の工夫はしています。
でもやっぱり、加工したものを論文に使っていいのかなとか（不正目的では無いですけれども）思うと、バチっと一枚で撮影したいと思っています。

蛍光の定量はもちろん、「参考所見」にとどめ、必ず別の実験で得られた結果について確認するようにしています。ただ、Image Jで計算してやると多くの場合それなりに信頼できる数字は得られるという手ごたえはあります。

＞montさん
ああ、逆転の発想！
確かに、そもそもチャンバー付スライドだと傾きませんね。
ただ、過去に松波のとNuncのを使ったことがあるのですが、プラスチックのチャンバーを張り付けていた接着剤が多少残るため、気泡が入りやすかったり、分厚くなって対物レンズが焦点を合わせられるまでに十分に近づけなくなったりなど問題があったため、使わなくなりました。
でも、教えていただいたibidi、一度試してみます！

あと封入剤を変えてみる件は、やっぱりするべきですよねぇ。
Mowiolは昔使ってた時、ちょっと柔らかすぎる気がして使わなくなったように記憶しているのですが、改めて考えてみようと思います。

＞ててさん
自作のチャンバースライドですね！
現在のラボは幸いお金はあるラボなので、montさんお勧めのものを試してみようかなと思っています。またお金のないラボに移ったらそういう工夫もありかもしれませんね。ありがとうございます！

＞あのさん、TSさん
やり取りを興味深く拝見いたしました。
私が下手なんだと思いますが、マニュキュア（のトップコートですよね？）はどうも完全に封入することが出来なくて、使わないようになりました。おっしゃる通り、こぼれてきたり、動いたりしてしまいます。
多分封入剤の量と、マニュキュアの塗り方に技がいるのかなぁと思います。

(無題)

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No.10246-9 - 2022/02/11 (金) 23:22:04 - TS

ってか、マニキュアでグリセロールは漏れないですよ。

(無題)

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No.10246-8 - 2022/02/11 (金) 22:33:16 - あの

表現悪かった。

漏れたグリセロールがレンズに行かないなら大丈夫。

実際には、倒立でも使うことあります。
その場合には、キムワイプの上でカバーグラスを押し潰して、
グリセロールがレンズに漏れ落ちないようにしてます。

(無題)

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No.10246-7 - 2022/02/11 (金) 21:33:21 - TS

> グリセロールとマニキュアの場合には、
顕微鏡は正立でないとダメだけど。

え？そうなんですか？
私は倒立で長年やってますが、なにかまずい？

(無題)

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No.10246-6 - 2022/02/11 (金) 21:21:39 - あの

グリセロールとマニキュアの場合には、
顕微鏡は正立でないとダメだけど。

(無題)

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No.10246-5 - 2022/02/11 (金) 19:31:19 - あの

案外、封入はグリセロールとマニキュアが良いかも。

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No.10246-4 - 2022/02/11 (金) 17:37:45 - てて

斜め上の回答かもしれませんがガラスボトムディッシュを使うなどしてスライドガラスに観察するではダメでしょうか？
プラのディッシュに穴を開けてシリコンでカバーガラスを貼り付けてそこに培養してました
仰るようにすぐ斜めになっちゃうんですよねぇ...

(無題)

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No.10246-3 - 2022/02/11 (金) 13:20:03 - mont

Prolong gold は固まる時の収縮率が大きいのか、細胞が極端にペッチャンコになってしまう印象です。
なので形態を重視する実験には向かないと、どこかで読んだことがあります。

私はMowiolにDABCOを入れて自作した封入剤を使っていますが、安いので余裕を持って使えるし、形態の保持、ペッチャンコ具合もProlong goldよりもマシな気がします。24x60mmのカバーグラスで80~100マイクロ使ってます(端からチョット染み出す量です)。

12mmのカバーグラスではなく、ibidiのチャンバースライドを使うのも良いかもしれません。
私は8ウェルを良く使いますが、スライドグラスの上にシリコンの仕切りが張り付いた構造になっています。コーティング、培養、固定、染色、洗浄が終わったら、シリコンをペロッと剥がして、封入剤、カバーグラスを載せます。なので、細胞はカバーグラスではなく、スライドグラスに貼りついた状態で観察することになります。万が一カバーグラスが多少傾いても、細胞は水平に保たれます。

https://ibidi.com/chamber-slides/45-8-well-chamber-removable.html

このチャンバースライドは少し値段が高いので、私は使用済みの「シリコンの仕切り」を再利用しています。蒸留水で洗ってアルコールに浸し(脂分があると綺麗に張り付かないので)、乾いたらスライドグラスのツルツルの面(裏側)に「シリコンの仕切り」を貼り付け、乾熱滅菌用の袋に入れてオートクレーブするだけです。3回ぐらいオートクレーブしても大丈夫です。貼り付けが甘いとたまーに漏れることがあるので、しっかり貼り付いている事を良く確認してからオートクレーブするのと、本番の大事な実験には未使用品を使うようにしています。

日本在住ではないので、日本の代理店は知らないのですが、頼めば無料の試供品を送ってくれるはずです(船便だかで、えらい時間がかかりますが)。

(無題)

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No.10246-2 - 2022/02/11 (金) 07:43:41 - iiii

難しいですよね。

カバーグラスをかぶせたあとにひっくり返す。
カバーグラスをかぶせたあとにコインを１枚置く。

などやったことがありますが、カバーグラスが汚れちゃうんですよね。

あとは諦めて観察を工夫するとか。共焦点で数枚分のエリアを撮影して縫い付けてますか？エリア設定するときに撮影中のレンズの高さを自動で調整する機能がありませんか？それをやるのと、ステッチを少し大きめにとって少しマシになりました。ただこれは組織でしました。

別の話で申し訳ありませんが、個人的にはそもそも顕微鏡で蛍光の定量は難しいと考えています。ましてや培養した細胞でしたらエリアが小さくブリーチもかかってきて難しいかも？

カバーグラスが傾かない技はありませんか？

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No.10246-1 - 2022/02/11 (金) 05:56:30 - nak

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