Bio Technical フォーラム

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ゲル抽出 トピック削除
No.10245-TOPIC - 2022/02/10 (木) 18:05:18 - はつ
アガロースで泳動した後、目的バンドのゲル切り出しを行い、TAKARAのNucleoSpin® Gel and PCR Clean-upでゲル抽出を行いました。
濃度が10ng/μL程度、A260/280は1.6付近、A260/230が0.1、ピークが220nm付近にありました。これはタンパク質の夾雑物が多いということでしょうか？プロトコール通りゲル抽出したのですが、、、
よろしくお願いします。
　
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No.10245-5 - 2022/02/11 (金) 21:24:36 - はつ
みなさんありがとうございます。
カオトロピック塩の対策プロトコールはしていたのですが改善しなかったです。
２％アガロースからゲル抽出していることから、アガロース成分のキャリーオーバーも考えられるということですかね。（以前は１％しか経験がなく、、）
タンパク質夾雑物は完全に勘違いしていました、、失礼しまいた。

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No.10245-4 - 2022/02/11 (金) 03:29:55 - おお
昔は２３０nmは測らなかったような。
グアニジンなどの持ち込みが一つの原因かなぁと思います。そういうのなら一度エタ沈するだけで数値は落ち着きます。あとはアガロースとかも入っているのかもしれませんそういうのはやはり低波長でつよい吸収が見られるだろうから。アガロースはエタ沈しても除けないでしょうがまあそんなにじゃまにならないだろうし。

タンパクが入っているっていうのは、状況を考えると可能性は殆どないと思えませんか？

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No.10245-3 - 2022/02/10 (木) 19:16:13 - AA
すでに指摘のあるとおりですが、NucleoSpinの添付プロトコルにはトラブルシューティングの最後に"Low ratio A260 / A230"の項目があり、そこにはカオトロピック塩のキャリーオーバーについての言及があります。その解決策の項には"シーケンス他云々におけるキャリーオーバーの項目を見ろ"と言う記載で、たどると最終的にはNT3のウォッシュを増やせと言う話になってますね。(このステップを増やすとNT3がカラムの本数分に足らなくなるとかそういうことまで載ってます。)

質問内容以外について言及するのは蛇足かもしれませんが、ご自身の目的に合わせて評価法を選んだほうがいいと思います。ゲル切り出しをしたのであれば特定の長さの核酸断片が必要な実験をしているのだと思いますので、その長さの断片がどのくらい含まれているのかを評価しないと意味がありません。極論、せん断されてブチブチになった物が溶けていても吸光度ではわかりません。

年令問わず、核酸となるとやたら吸光度測定をしたがる人がいますよね。。。

(無題) 削除/引用
No.10245-2 - 2022/02/10 (木) 18:55:33 - G25
マニュアル世代の傾向なのか、なんだかRatioを過信しすぎ、依存しすぎのように思う。

ゲル抽出で1.6なら、実用上、ほとんど問題になることはないと思うけど。
なんでゲル抽出でタンパク質が夾雑すると思うんでしょうか？ もっとreasonableに考えたらいいと思います。

一応、マニュアルのトラブルシューティングの項に、Raioが低い場合のことも触れられているのだけれど（カオトロピック塩が十分に除けていないとか）、それに従って検討はしたろうか。

最後にこれは単に流儀の問題かもしれないが、
吸光度、nanodropなんかより泳動でチェックすることをおすすめする。ちゃんと目的のものが取れているか、変性していないか（しばしばカオトロピック塩を使ったシリカの系では二本鎖が変性して乖離することがある、余計な断片は混じっていないか、収量はどれくらいか（マーカーとの比色でおおよその量がわかる。吸光度より干渉されることがないのでreasonable)、吸光度より情報が多く時としてうより正確ですらある。

ゲル抽出 削除/引用
No.10245-1 - 2022/02/10 (木) 18:05:18 - はつ
アガロースで泳動した後、目的バンドのゲル切り出しを行い、TAKARAのNucleoSpin® Gel and PCR Clean-upでゲル抽出を行いました。
濃度が10ng/μL程度、A260/280は1.6付近、A260/230が0.1、ピークが220nm付近にありました。これはタンパク質の夾雑物が多いということでしょうか？プロトコール通りゲル抽出したのですが、、、
よろしくお願いします。
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